Separation and Quantitation of Total Plasma Homocysteine and Methylmalonic Acid by LC-MS/MS Analysis

Separační a kvantitativní analýza celkového plazmatického homocysteinu a methylmalonové kyseliny metodou LC-MS/MS

Význam tématu

Celkový plazmatický homocystein a methylmalonová kyselina jsou klíčové ukazatele stavu metabolismu methioninu a vitaminu B12. Zvýšené hladiny homocysteinu indikují riziko kardiovaskulárních onemocnění a genetické poruchy enzymatické přeměny, zatímco methylmalonová kyselina slouží jako citlivý marker deficitu vitaminu B12. Spolehlivá a rychlá kvantifikace těchto metabolitů je nezbytná pro diagnostiku a sledování léčby řady metabolických a výživových poruch.

Cíle a přehled studie

Studie byla zaměřena na vývoj a validaci čtyřminutové LC-MS/MS metody pro simultánní separaci a stanovení celkového homocysteinu a methylmalonové kyseliny v plazmě. Doplňkově se vyhodnocovala chromatografická separace methioninu, cysteinu, sukcinátu a cystathioninu, což umožňuje komplexní vyšetření poruch týkajících se kobalaminu.

Použitá metodika a instrumentace

Odběr a příprava vzorků

• 100 μl plazmy bylo ošetřeno 5 μl vnitřního standardu a redukčním činidlem dithiothreitolem
• inkubace při pokojové teplotě po dobu 30 minut pro úplnou redukci disulfidických vazeb
• proteinová precipitace pomocí 300 μl methanolu a centrifugace
• supernatant byl injektován do LC-MS/MS systému

Chromatografie a detekce

• Analytická kolona typu Polar X 50×2,1 mm s částicemi 2,7 µm a odpovídající guard kolona
• Mobilní fáze A voda s 0,5 % kyseliny mravenčí, fáze B acetonitril
• gradient od 55 do 85 % fáze B během 3 minut, celková doba běhu 4 minuty
• hmotnostní spektrometrie v módu MRM s optimalizovanými přechody pro jednotlivé analyty

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace redukčního kroku ukázala, že 30 minut inkubace s dithiothreitolem zajistí maximální obnova homocysteinu. Kalibrační křivky pro homocystein (50–5000 ng/ml) i methylmalonovou kyselinu (25–5000 ng/ml) vykázaly vynikající linearitu s hodnotami r2 nad 0,995. Mezi-denní i intra-denní přesnost a správnost byly v rozmezí do 15 % od nominálních hodnot a relativní rozptyl pod 15 %. Chromatografická separace byla reprodukovatelná až po 500 kontinuálních injekcích bez pozorovatelného carryover. Izobarická interference sukcinátu byla úspěšně vyřešena baseline separací.

Přínosy a praktické využití metody

Nová metoda nabízí výrazné zkrácení doby analýzy a jednoduchou přípravu vzorků, což zvyšuje propustnost laboratoře a minimalizuje spotřebu biologického materiálu. Současné stanovení více klíčových metabolitů podporuje diferenciální diagnostiku poruch kobalaminu bez nutnosti dalších laboratorních testů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze dále rozvíjet integrací plně automatizovaného zpracování vzorků a multiplexních panelů pro širší spektrum metabolitů. Výhledově je možné uplatnit pokročilé kolonové materiály a vysokorozlišenou spektrometrii pro zvýšení selektivity a citlivosti analýzy.

Závěr

Vyvinutá čtyřminutová LC-MS/MS metoda pro stanovení celkového homocysteinu a methylmalonové kyseliny v plazmě se vyznačuje vysokou spolehlivostí, reprodukovatelností a praktickou použitelností v klinické a průmyslové diagnostice.

Reference

• Jiang Y et al Clinica Chimica Acta vol 464 2017 pp 93-97
• Persichilli S et al Journal of Separation Science vol 33 no 20 2010 pp 3119-3124
• Weaving G et al Ann Clin Biochem vol 43 2006 pp 474-480