Separation and Quantitation of Total Plasma Homocysteine and Methylmalonic Acid by LC-MS/MS Analysis

Význam tématu

Homocysteín a methylmalonová kyselina jsou klíčovými ukazateli funkce metabolismu vitaminů skupiny B. Zvýšené hladiny homocysteinu mohou indikovat hyperhomocysteinémii či homocystinurii, zatímco methylmalonová kyselina slouží jako marker nedostatku vitaminu B12, spojeného s methylmalonovou acidemií či megaloblastickou anémií. Spolehlivá a rychlá analýza těchto metabolitů je zásadní pro diagnostiku, monitorování terapie a diferenciální diagnostiku kobalaminových poruch.

Cíle a přehled studie

Studie si kladla za cíl vyvinout čtyřminutovou metodu LC-MS/MS umožňující simultánní stanovení celkového homocysteinu (monomerní i vázaného ve formě homocystinu) a methylmalonové kyseliny v plazmě. Zároveň byla optimalizována příprava vzorků pomocí redukce DTT a chromatografické podmínky tak, aby došlo k odlišení isobarických interferencí, zejména sukcinové kyseliny.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• 100 µL plazmy s interními standardy (DL-homocysteine-d4, MMA-D3)
• Redukce 20 µL 0,5 M DTT, inkubace 30 minut při pokojové teplotě
• Precipitace 300 µL methanolu, centrifugace 10 minut při 4000 rpm
• Supernatant injektován do LC-MS/MS

Chromatografie a detekce:

• Kolona Raptor Polar X 50×2,1 mm, 2,7 µm se strážní kolonkou
• Mobilní fáze A: 0,5 % kyselina mravenčí ve vodě; B: acetonitril; gradient 55→10→85 % B za 4 minuty
• Průtok 0,6 mL/min, teplota 40 °C, objem injekce 5 µL
• MS/MS v režimu SRM, pozitivní i negativní ionizace podle analytu

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala:

• Linearity v rozsahu 50–5000 ng/mL pro homocysteine a 25–5000 ng/mL pro MMA, r2 ≥ 0,995
• Přesnost a přesnost (accuracy a precision) v inter- i intra-denním měření s odchylkami do ±15 % a RSD ≤ 12 %
• Optimální doba inkubace DTT 30 minut pro maximální obnovu homocysteinu
• Chromatografické rozlišení všech analyzovaných látek včetně methioninu, cysteinu, sukcinové kyseliny a cystathioninu během 4 minut bez carry-over
• Robustnost při více než 500 injekcích a mezi kolonkami stejné série

Přínosy a praktické využití metody

Nová metoda nabízí:

• Rychlou a snadnou přípravu vzorků s minimem kroků
• Simultánní stanovení klíčových metabolitů pro různé kobalaminové i transsulfační poruchy
• Vysokou propustnost a reprodukovatelnost vhodnou pro rutinní klinické laboratoře

Budoucí trendy a možnosti využití

Budoucí vývoj může směřovat k automatizaci přípravy vzorků, miniaturizaci a digitalizaci datového zpracování. Dále je možné rozšířit panel o další vitaminy a jejich metabolity, využít vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie nebo aplikovat metodu ve screeningových programech novorozeneckých vyšetření.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda umožňuje během čtyř minut přesné a spolehlivé stanovení celkového homocysteinu a methylmalonové kyseliny v human plasma. Optimalizovaná příprava s DTT a robustní chromatografické podmínky poskytují vynikající linearitu, přesnost i opakovatelnost, což umožňuje široké klinické i výzkumné využití.

Reference

1. Jiang Y et al Simultaneous determination of plasma total homocysteine and methionine by liquid chromatography tandem mass spectrometry Clin Chim Acta 464 2017 93-97
2. Persichilli S et al A Simplified Method for the Determination of Total Homocysteine in Plasma by Electrospray Tandem Mass Spectrometry J Sep Sci 33 2010 3119-3124
3. Weaving G et al Simultaneous quantitation of homocysteine cysteine and methionine in plasma and urine by LC MS MS Ann Clin Biochem 43 2006 474-480