An Integrated Workflow for the Analysis of Oligonucleotides and Their Impurities by Agilent High-Resolution LC/(Q-)TOF Mass Spectrometry

Význam tématu

Oligonukleotidy představují rostoucí třídu bioterapeutik (siRNA, antisense, aptamery, CRISPR vodiče) vyžadující přesnou analýzu cílového produktu a jeho vedlejších produktů. Charakterizace nečistot (trunkace, prodloužení, abasic, konverze vazeb) je klíčová pro bezpečnost a kvalitu farmaceutických přípravků. Integrované, automatizované metody s vysokým rozlišením zkracují čas analýzy a zvyšují spolehlivost výsledků.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout workflow Target Plus Impurities (TPI) pro rozdělení, identifikaci a relativní kvantifikaci oligonukleotidů a jejich nečistot pomocí vysoce výkonné LC/(Q-)TOF MS a softwaru Agilent MassHunter BioConfirm 12.0. Studie demonstruje dvě strategie zpracování dat: cílenou (Find-by-Formula) a neřízenou (Maximum Entropy Deconvolution).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky čistých standardů DNA/RNA (21-, 40- a 100-mer) byly připraveny v DI vodě při 2 pmol/μl nebo 0,4–0,5 mg/ml. Separace probíhala na Agilent 1290 Infinity II LC s AdvanceBio Oligonucleotide kolonkou (2,1×50 mm, 2,7 μm), teplota 65 °C, tok 0,5 ml/min, 11minutový gradient (15 mM TEA/400 mM HFIP vs. methanol). Detekce na Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF v negativním režimu. Zpracování dat v MassHunter BioConfirm 12.0 s nástroji Find-by-Formula a Maximum Entropy.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda zajišťuje rozlišení DNA a RNA ladder standardů (15–40 mer a 14–21 mer) během 4–7 minut chromatografie. Monoisotopické i průměrné hmotnosti byly určeny s přesností sub-ppm pro menší a <10 ppm pro 100 mer. Softwarový workflow identifikoval 19 5′ truncací 21 mer s RSD <3 % relat. kvantifikace a nízkou chybou hmotnosti. U 40 mer a 100 mer byly detekovány nízkoúrovňové truncace a prodloužení až 0,65 % obsahu s vysokou přesností a opakovatelností.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný TPI workflow snižuje dobu analýzy a eliminuje ruční zpracování, poskytuje robustní QC nástroj pro farmaceutické laboratoře, výzkum i kontrolu kvality. Umožňuje spolehlivou detekci nečistot i u složitých oligonukleotidových přípravků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření na pokročilé MS/MS sekvenační workflow, zvýšení citlivosti a integrace umělé inteligence pro hlubší profiling neznámých modifikací. Dále se plánuje adaptace na nové modality (aptamery, mRNA vakcíny, CRISPR RNA) a vysokopropustné platformy.

Závěr

Navržené integrované řešení LC/(Q-)TOF MS společně se softwarem BioConfirm 12.0 umožňuje rychlou a spolehlivou analýzu oligonukleotidů a jejich nečistot. Workflow nabízí vysoké rozlišení chromatografie, vynikající přesnost hmotnostního měření a automatizovanou datovou analýzu, což vede k významnému zkrácení času a zvýšení robustnosti QA/QC procesů.

Reference

• Capaldi D. et al. Impurities in Oligonucleotide Drug Substances and Drug Products. Nucleic Acid Ther. 2017, 27, 309–322.
• Okafo G.; Elder D.; Webb M. Analysis of Oligonucleotides and Their Related Substances. ILM Publications 2012.