Comprehensive and Integrated Workflow for Oligonucleotide Sequence Confirmation by Agilent High-Resolution LC/Q-TOF

Význam tématu

Analytika syntetických oligonukleotidů hraje klíčovou roli ve vývoji modernách biopharma protirakovinových a geneticky orientovaných léčiv. Přesná identifikace sekvence, modifikací a příslušných nečistot je základním požadavkem pro zajištění kvality, účinnosti a bezpečnosti molekul používaných v klinickém výzkumu a průmyslové výrobě.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikačního poznámky bylo demonstrovat plně integrovaný workflow pro potvrzení sekvence oligonukleotidů za využití Agilent 1290 Infinity II LC, Agilent 6545XT AdvanceBio LC Q-TOF a softwaru MassHunter BioConfirm 12.0. Studie se zaměřila na rychlou (<1 minuta) a důkladnou analýzu krátkých oligonukleotidů a jejich nečistot v jediném injektu.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza probíhala na Agilent 1290 Infinity II LC s AdvanceBio oligonukleotidovou kolonou a dvoufázovým gradientem TEA/HFIP a methanolu. Detekce byla realizována pomocí ESI v záporném módu na Q-TOF 6545XT s nastavenými parametry zdroje (teplota 275 °C, zdrojový napětí VCap 3500 V). Pro zpracování dat sloužil MassHunter BioConfirm 12.0, který automatizovaně generuje teoretická fragmentační mapování a porovnává je s naměřenými daty.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaný LC/MS/MS postup dosáhl sub-ppm hmotnostní přesnosti a baseline chromatografického rozlišení pro standards 14-, 17-, 20- a 21-mer RNA. Softwarový algoritmus poskytl 100% pokrytí sekvence z jednoho injektu u všech testovaných vzorků včetně těžce modifikovaného ASO, isomerních 21-mer, dvouvláknové DNA a 5′-trunkovaných nečistot. Fragmentační data pro náročné modifikace prokázala vysokou citlivost a spolehlivost identifikace.

Přínosy a praktické využití metody

• Zrychlení a automatizace sekvenačního potvrzení oligonukleotidů v kvalitativní a kvantitativní analýze
• Univerzální přístup pro různé typy vzorků: RNA, DNA, antisense oligonukleotidy
• Schopnost detekovat a potvrdit nízkoabundantní nečistoty a izomery
• Implementace v QA/QC laboratořích biotechnologického a farmaceutického průmyslu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší nasazení integrovaných LC/MS/MS workflow kombinovaných s umělou inteligencí pro automatické vyhodnocování výsledků a predikci neznámých modifikací. Další rozvoj vysokorychlostních separačních technik a rozšíření analýzy na delší oligonukleotidy či konjugované molekuly zvýší účinnost vývoje nových léčiv.

Závěr

Popsaný workflow s použitím Agilent LC/Q-TOF a BioConfirm 12.0 poskytuje robustní, citlivou a plně automatizovanou platformu pro rychlou sekvenační validaci oligonukleotidů s vysokou přesností hmotnostního měření a kompletní fragmentační pokrytí.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II LC (High-Speed Pump, Multisampler, Multicolumn Thermostat)
• AdvanceBio oligonukleotidová kolona 2.1 × 50 mm, 2.7 µm
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Jet Stream ESI
• Agilent MassHunter BioConfirm software verze 12.0

Reference

1. Wong D L, Rye P Sequence Confirmation Workflow for Oligonucleotides and Impurities by Agilent High-Resolution LC/Q-TOF Mass Spectrometry Agilent Technologies Application Note 5994-4817EN 2022
2. McLuckey S P, et al Tandem Mass Spectrometry of Small Multiply Charged Oligonucleotides J Am Soc Mass Spectrom 1992 3 60-70
3. McCloskey J A, et al Interpretation of Oligonucleotide Mass Spectra for Determination of Sequence Using ESI and Tandem Mass Spectrometry Anal Chem 1996 68 1989-1999
4. Bahal R, et al Antisense Oligonucleotides An Emerging Area in Drug Discovery and Development J Clin Med 2020 9 2004