Fast and Reliable Method for the Analysis of Testosterone, Androstenedione, and 17-hydroxy Progesterone from Human Plasma

Význam tématu

Steroidní hormony jako testosteron, androstenedion a 17-hydroxyprogesteron jsou klíčové biomarkery v klinické diagnostice, endokrinologii i v kontroly dopingu. Jejich koncentrace v lidské plazmě se mohou pohybovat od velmi nízkých až po vysoké hodnoty, což klade nároky na citlivou, rychlou a reprodukovatelnou analytickou metodu. Mikroměřítkové SPE následované LC-MS/MS představuje moderní přístup, který umožňuje důkladné očištění matric, vysokou propustnost vzorků a minimalizaci matriceových efektů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem popsané studie bylo vyvinout vysoce propustnou, přesnou a citlivou metodu pro simultánní stanovení testosteronu, androstenedionu a 17-hydroxyprogesteronu z lidské plazmy. Metoda využívá mikroměřítkové pevné fáze (SOLAµ HRP), separaci na kolóně Syncronis C18 a detekci na trojitém kvadrupólu s atmosférickou tlakovou chemickou ionizací (APCI). Studie hodnotila linearitu, přesnost, opakovatelnost, zotavení analyzátů a matriceové efekty v jak v surrogátním pufru, tak v autentické plazmě.

Použitá instrumentace

• Spektrální extrakce: SOLAµ HRP 96well SPE deska
• Chromatografie: Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 RSLC systém
• Kolona: Syncronis C18 1,7 µm, 100 × 2,1 mm s Hypersil GOLD 5 µm, 10 × 4 mm drop-in strážnou kolonkou
• Detekce: Thermo Scientific TSQ Quantiva trojitý kvadrupól MS, ionizace APCI v pozitivním módu
• Další vybavení: vakuové SPE manifold, 96-well microplate, LC-MS grade rozpouštědla a pufry

Použitá metodika

Vzorky plazmy nebo PBS byly smíchány s interním standardem (corticosteroid-d8) a okyseleny 0,1 % kyselinou mravenčí. SPE deska byla kondicionována metanolem a vodou, vzorky byly naloženy, promyty vodou s 0,1 % kyseliny a 40 % metanolem a následně eluovány metanolem. Eluát se zředil formiátovým roztokem před injekcí 15 µl na LC-MS/MS. Chromatografický gradient v rozsahu 50 % až 100 % acetonitrilu umožnil oddělení všech analyzátů pod 4 minuty při průtoku 0,3 ml/min a teplotě kolony 45 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

• Lineární rozsah 0,5–500 ng/ml pro všechny tři hormony s regresními koeficienty R2 ≥ 0,990
• Přesnost (% bias) v kalibračních bodech v PBS do ±15 % a v QC vzorcích v plazmě do ±5 %
• Reprodukovatelnost (% RSD) QC vzorků do 11 %
• Zotavení analytů 92–111 % a minimální matriceové efekty (±13 %) jak v PBS, tak v plazmě
• Stanovení endogenních hladin v plazmě (testosteron ≈ 3,7 ng/ml, androstenedion ≈ 1,3 ng/ml, 17-hydroxyprogesteron ≈ 2,6 ng/ml)

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou a spolehlivou analýzu steroidních hormonů z omezeného objemu vzorku s vysokou citlivostí a nízkými náklady na sorbenty i rozpouštědla. Použití surrogátní matrice (PBS) pro kalibraci s ověřením stability na plazmatických QC zajišťuje flexibilitu pro klinické i výzkumné aplikace a usnadňuje sledování patologických i fyziologických hladin hormonů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření multiplexních LC-MS/MS metod pro současné kvantifikace většího počtu steroidů či dalších biologických markerů. Další miniaturizace SPE spotřebuje méně vzorku a reagencií, zatímco automatizace a online propojení SPE-LC-MS zvyšuje throughput a zabezpečuje konzistenci výsledků. Integrace do klinických laboratoří a rozvoj nových ionizačních zdrojů mohou dále zlepšit citlivost a robustnost analýzy.

Závěr

Popsaná mikroměřítková SPE-LC-MS/MS metoda pro stanovení testosteronu, androstenedionu a 17-hydroxyprogesteronu v lidské plazmě prokázala výborné analytické parametry, vysokou průchodnost a nízkou náchylnost k matriceovým efektům. Díky použití SOLAµ HRP SPE a Syncronis C18 kolony je možné rychlé nasazení v klinických, farmaceutických a sportovně-kontrolních laboratořích.

Reference

• Thermo Fisher Scientific. Fast and Reliable Method for the Analysis of Testosterone, Androstenedione, and 17-hydroxy Progesterone from Human Plasma. Application Note AN21173, 2015.