MS1 Oligonucleotide Characterization Using LC/Q‑TOF with HILIC Chromatography

Význam tématu

Charakterizace syntetických oligonukleotidů je klíčová pro výzkum a QA/QC v biotechnologiích a farmaceutickém průmyslu.
Metoda LC/Q-TOF spojená s HILIC chromatografií umožňuje rychlou separaci a vysoce přesnou hmotnostní analýzu bez rizika kontaminace iont-párovacími činidly.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat analytickou platformu pro separaci a MS1 identifikaci oligonukleotidů v širokém rozsahu velikostí a chemických modifikací s vyloučením iont-párovacích prostředků.
Studie zahrnuje:

• Oligo žebřík 20–100 merů
• Variabilní báze na koncích (mixed base)
• Aptamery a siRNA duplexy

Použitá metodika a instrumentace

Metoda využívá HILIC chromatografii na kolóně Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z (2,1×100 mm, 1,9 µm) ve spojení s mobilními fázemi na bázi 15 mM acetátu amonného v acetonitrilu/vodě.
MS detekce probíhala na Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF s duálním JetStream zdrojem v negativním režimu.
Klíčové parametry:

• Teplota kolony 30 °C, průtok 0,4 mL/min
• Gradient 15→40→60 % organiky v 15 minutách
• Zachování citlivosti pro metody bez iont-párování

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaná metoda dosáhla baseline separace 20–60 merů a mírného překryvu pro 80 a 100 merů, bez dopadu na určení intact mass.
HILIC podmínky přinesly tzv. "native-like" rozložení nábojových stavů, zachovaly vyšší struktury (např. siRNA duplex) a umožnily detekci nízkoúrovňových nečistot s dynamickým rozsahem přes pět řádů.
Analýza směsí bez chromatografického rozlišení potvrdila možnost rozlišovat komponenty podle dekonvoluovaných hmotností (různé báze C/A/G).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlou výměnu mezi pozitivním a negativním režimem MS bez dlouhého proplachu
• Vysokou reprodukovatelnost retence s 10min re-ekvilibrací a RT RSD <0,1 %
• Měření intact mass a profil nečistot v jediném běhu

Budoucí trendy a možnosti využití

Využití HILIC-Q-TOF metodiky se rozšiřuje na analýzu mRNA, antisense oligonukleotidů a další komplexní biopolymerní aplikace.
Moderní kolony s povrchově porézními částicemi a expanze mobilních fází podél vyšších pH mohou ještě zlepšit retenci a rozlišení modifikovaných sekvencí.

Závěr

Studie prokázala univerzální přístup k LC/Q-TOF charakterizaci oligonukleotidů bez iont-párování. Výsledky ukazují spolehlivou separaci, vysokou přesnost hmotnostního určení, zachování struktury a citlivou detekci impurit v širokém rozsahu velikostí a chemických úprav.

Reference

1. Rye, P. a Schwarzer, C. LC/Q-TOF Oligonucleotide Characterization Using HILIC Chromatography. Agilent Technologies Application Note, 2023.
2. Lobue, P. et al. Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography–Mass Spectrometry in the Absence of Ion-Pair Reagents. J. Chromatogr. A, 1595, 39–48 (2019).
3. Guimaraes, C. et al. Role of Mobile Phase pH in Oligonucleotide Ion-Pair LC-MS. Future Science OA, FSO753 (2021).
4. Guo, Y. et al. Secondary Structural Characterization of Oligonucleotides by ESI-MS. Nucleic Acids Res., 33(11), 3659–3666 (2005).
5. Buszewski, B. a Noga, S. Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography – Powerful Separation Technique. Anal. Bioanal. Chem., 402(1), 231–247 (2012).