High-throughput, Ion-Pairing-Free, HILIC Analysis of Oligonucleotides Using Agilent RapidFire Coupled to Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry

Význam tématu

Analýza oligonukleotidů je klíčová pro vývoj léčiv, diagnostiku a kontrolu kvality syntetických aminokyselinových řetězců. Vysoká propustnost a citlivost metod umožňuje rychlé vyhodnocení komplexních vzorků a detekci nízkoprocentních nečistot, což přispívá k efektivitě laboratorních procesů a spolehlivosti výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje iontově neparující, vysoce výkonnou HILIC metodu pro charakterizaci oligonukleotidů v kombinaci s Agilent RapidFire a Q-TOF hmotnostním spektrometrem. Cílem je dosáhnout 12sekundového cyklu, vysoké robustnosti, reprodukovatelnosti, širokého dynamického rozsahu a citlivosti v jednotkách nanomolárních koncentrací, a to pro různé délky a chemické modifikace oligonukleotidů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro online extrakci a separaci byl použit Agilent RapidFire 365 systém spojený s Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF MS s Agilent Jet Stream zdrojem. Použitá cartridge HILIC-Z (typ H6, objem 4 μl, PN G9527) zajišťuje retenci a desalting. Mobilní fáze A i B obsahují acetonitril a 15 mM acetátu amonného bez úpravy pH. Postup zahrnuje:

• Aspirace vzorku (600 ms).
• Desalting cartridge MPA, 1 mL/min, 5 000 ms.
• Eluce do MS pomocí MPB, 0,5 mL/min, 4 000 ms.
• Reekvilibrace cartridge 500 ms.

Parametry MS: negativní ionizační režim, rozsah m/z 100–3 200, rychlost akvizice 4 spektra/s, teplota zdroje 300 °C, proud sušícího plynu 11 L/min, kapilární napětí 3 500 V.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje konstantních 12 s cyklů s vysokou reprodukovatelností signálu i relativních poměrů izotopických šarží. Dynamický rozsah umožňuje detekci nečistot pod 0,5 % cílové složky. Lineární odpověď signálu přes více než tři dekády koncentrací (R2 ≈ 0,999) a limity detekce v jednotkách nanomolární koncentrace byly prokázány na poly-dT oligu. Srovnání HILIC versus iontově párového IPRP režimu ukázalo užší a méně nabité šarže u HILIC, ačkoli celková citlivost může mírně klesat u vyšších oligonukleotidů (60mer). Univerzálnost metody demonstrovaly analýzy 18–28mer DNA, ASO a aptamerů s různými modifikacemi.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zrychlení analýzy díky 12 s cyklu bez potřeby výměny chemikálií nebo hardware.
• Odstranění iontově parujících činidel umožňuje rychlý přechod mezi pozitivním a negativním režimem.
• Vysoká robustnost a reprodukovatelnost pro rutinní kontrolu kvality a vývoj procesů.
• Detekce stopových nečistot a lineární měření koncentrací až v jednotkách nanomolárů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda může být dále rozšiřována na analýzu dlouhých a velmi modifikovaných oligonukleotidů, včetně mRNA a siRNA. Integrace s automatizovanými platformami a datovými workflow ulehčí vysokopropustný screening v préklinickém vývoji léků a personalizované diagnostice. Vývoj pokročilých dekonta-minačních algoritmů umožní rychlejší a přesnější vyhodnocení složitých vzorků.

Závěr

Agilent RapidFire HILIC-Q-TOF metoda nabízí unikátní kombinaci rychlosti, jednoduchosti a citlivosti pro charakterizaci oligonukleotidů. Bez iontově parujících činidel dosahuje vysoké reproducibility, dynamického rozsahu a univerzálnosti, což ji činí vhodnou pro široké spektrum aplikací v analytické chemii a biotechnologiích.

Reference

1. Rye, P.; Yang, Y. High-throughput Mass Spectrometry of Synthetic Oligonucleotides: A Comparison of Data from Fast LC and RapidFire Methods. ASMS 2020.
2. Lobue, P. A. et al. Oligonucleotide Analysis by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in the Absence of Ion-Pair Reagents. J. Chromatogr. A 2019, 1595, 39–48.
3. Huang, M.; Xu, X.; Qiu, H.; Li, N. Analytical characterization of DNA and RNA oligonucleotides by hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2021, 1648, 46–2184.