RapidFire for Automated High-Throughput LC/MS

Význam tématu

RapidFire vysokoprůchodový MS systém významně zkracuje dobu analýzy vzorků v LC/MS aplikacích díky ultrarychlému on-line SPE a přímému vstřikování do hmotnostního analyzátoru. Systém podporuje široké spektrum metod výzkumu — od farmaceutické vývojové fáze, přes ADME testování, analýzu oligonukleotidů až po klinickou a toxikologickou aplikaci. Rychlá detekce, robustnost a schopnost pracovat s minimálním objemem vzorku otevírá nové možnosti pro high-throughput screening a šetří čas i náklady laboratorních postupů.

Cíle a přehled studie / článku

Prozkoumat a demonstrovat různé aplikace Agilent RapidFire systému:

• Sub-2,5s přímé vstřikování pro masivní sériové screenings (RapidFire Direct Injection Mode).
• Automatizované vývoje metod pomocí přepínání pufrů a cartridgí (RapidFire Method Development).
• Snížení objemu vzorku na 5–10 µL díky použití nízkoodporových kapilár (Minimization of Sample Volume).
• Analýzu oligonukleotidů HILIC bez iontově-párovacích činidel pro pozitivní režim MS (HILIC Oligonucleotide Analysis).
• Komparaci fast LC versus RapidFire pro syntetické oligonukleotidy (High-Throughput Oligo LC vs RF).
• Vyhledávání fragmentů v drug discovery na modelech BACE-1 a SCD (Fragment-Based & Lead Discovery).
• Ultrafast ADME test stability microsomálních reakcí (Microsomal Metabolic Stability).
• Klinickou aplikaci rychlé kvantifikace levetiracetamu v séru (<10s/ vzorek).
• Potenciál pro toxikologické a forenzní screeningy (Feasibility for Drug Target Screening).

Použitá metodika a instrumentace

Využití přístrojů:

• Agilent RapidFire 365/360/400 pro ultrarychlé on-line SPE a vstřikování (objemy 5–10 µL).
• Trojnásobný kvadrupól (Ultivo, 6460, 6470 TQ) pro MRM kvantifikaci.
• Q-TOF systémy (6545, 6545XT) pro vysokorozlišovací exact mass a auto-MS/MS zajišťující library match.
• UHPLC (1290 Infinity II, AdvanceBio) pro fast LC metody (60s cykly).
• Použitá SPE cartridgí (C4, C18, PLRP-S, HILIC-Z) a optimalizované eluční protokoly (pumpy, časy stavů RF).
• Software Agilent MassHunter (Acquisition, Qualitative, Quantitative), RapidFire Integrator, PCDL Manager pro automatizovanou detekci a vyhodnocení.

Hlavní výsledky a diskuse

• Direct Injection: sub-2,5s cyklus, 35 000 vzorků/den, lineární odezva do 4 dekád, CV ~1–2 %.
• Automated Method Dev.: Optimalizace bufferů, cartridge, acetonitrilu v minutách bez manuální výměny.
• Minimální objem vzorku: úspora z 35 µL na 10 a 5 µL/analýzu, CV 2–4 %.
• HILIC Oligos: Analýza 18–60mer bez iontových párů, zúžené nabití, zlepšená robustnost, limity nízkých nM.
• Fast LC vs RF pro oligos: RF poskytl rychlejší throughput (15s vs 40s), lepší odsolení, dostatečnou citlivost.
• BACE-1 screening: FS vs LMS vs UMS metody odhalily různé sady hitů, RF/MS potvrdil hits i u netagovaných substrátů.
• Lead Discovery SCD: RapidFire/TQ vs LC/TQ shoda výsledků (R2 ≈0,94), 10s vs >60s/smíchaný cyklus.
• MMS Stability: RF/TQ vs LC/TQ (R2 ≈0,94), intraday/interday přesnost 2–5 %, 10× rychlejší analýza.
• Levetiracetam v séru: 9,5s cyklus, lineární 1–100 µg/mL, přesnost 95–105 %, korelace s LC/TQ R2 >0,995.
• Forenzní screening: RF/Q-TOF 10s cyklus, auto-MS/MS + PCDL scoring eliminuje falešné pozitivy, 60× rychlejší než 10min LC/TOF.

Přínosy a praktické využití metody

RapidFire/MS systémy umožňují:

• Rapidní high-throughput screening (až stovky tisíc vzorků/den) bez chromatografie.
• Vysoce přesné kvantifikace i citlivé spolehlivé screeningy netagovaných biologických molekul.
• Snižování nákladů a spotřeby vzorku díky malým objemům (5–10 µL) a bez potřeby drahých reagentů.
• Automatizovaná výměna cartridge a bufferů pro snadnou optimalizaci nových metod.
• Zvýšení robustnosti a snížení falešných pozitiv skrze vysokorozlišovací exact mass a library PCDL.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikací do klinické diagnostiky, personalizované medicíny a TDM (Therapeutic Drug Monitoring).
• Integrace s robotizovanými platformami pro plně autonomní laboratoře.
• Další zlepšení citlivosti a specificity přes vývoj nových cartridge a ionizačních technik.
• Využití umělé inteligence pro adaptivní optimalizaci metod v reálném čase.
• Možnost multiplexních analyz bez separace pomocí sofistikovaných databází fragmentačních vzorů.

Závěr

Agilent RapidFire high-throughput MS a RF/Q-TOF či RF/TQ kombinují rychlost a kvalitu dat tradiční LC/MS v jednotkách sekund na vzorek. Umožňují široké spektrum aplikací od analytických nástrojů pro průmyslovou a klinickou chemii až po forenzní screening. Metody přinášejí významné úspory času, snížení spotřeby vzorků a umožňují robustní high-throughput workflow bez kompromisů v citlivosti či přesnosti.

Reference

• Abyade HC et al. Sub-2.5s direct injection LC/MS with Agilent RapidFire. Agilent Application Note, 2021.
• Frick LE, LaMarr WA. Automated method development on Agilent RapidFire. Agilent Application Note, 2014.
• Rye P et al. Minimization of sample volume for RapidFire MS. Agilent Technical Overview, 2021.
• Rye P et al. Ion-pairing-free HILIC of oligonucleotides. Agilent Application Note, 2019.
• Rye P, Yang Y. RapidFire vs fast LC for synthetic oligos. Agilent Application Note, 2022.
• Frick L, LaMarr W. Fragment-based screening BACE-1 by RapidFire MS. Agilent Application Note, 2013.
• LaMarr W et al. High-throughput lead discovery SCD with RapidFire/MS. Agilent Application Note, 2011.
• Choi N et al. Ultrfast microsomal stability with RapidFire/TQ. Agilent Application Note, 2021.
• Romm MV, Miller VP. Ultrafast levetiracetam serum analysis. Agilent Application Note, 2011.
• Nelson B et al. Forensic drug screening by RF/Q-TOF. Agilent Application Note, 2022.