High aspect ratio pillar array columns for deep proteome profiling at moderate LC pump pressures

Význam tématu

Metoda kapalinové chromatografie s použitím sloupců založených na uspořádaném poli pilířků je klíčová pro hluboké proteomické analýzy. Optimalizace rozměrů pilířkové matrice umožňuje dosáhnout vysoké účinnosti separace při nižším tlaku, což zvyšuje citlivost, zkracuje doby analýzy a zlepšuje reprodukovatelnost v routine LC–MS experimentech.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout a otestovat druhou generaci pilířkových kolonek (GEN2) a její novou verzi µPAC Neo se zvýšeným poměrem výšky průřezu ku jeho šířce (high aspect ratio) pro hlubokou analýzu proteomu. Studie porovnávala gény kolon (GEN1 vs. GEN2 vs. µPAC Neo) z hlediska teoretického počtu destiček, doby analýzy a provozního tlaku.

Použitá metodika a instrumentace

• Kolonky: Thermo Scientific µPAC GEN2 (pilířky Ø 2,5 µm, mezipilířkový prostor 1,25 µm) a µPAC Neo (pilířky Ø 2,5 µm, hloubka drážek 16–30 µm) o délkách 50 a 110 cm.
• Chromatograf: nanoLC systém s maximálním provozním tlakem 400 bar.
• Vzorky: směs uracilu a alkylfenonů pro isokratické testy; lidský buněčný lyzát pro bottom-up proteomiku.
• Detekce: UV při 260 nm a následná MS analýza.
• Připojení: nanoViper™ konektory (20 µm ID / 280 µm OD) s grounding kabelem pro stabilní ionizaci.

Hlavní výsledky a diskuse

• GEN2 50 cm AR 2,4 dosáhla 160 000 teoretických destiček za 15 min při 350 bar.
• µPAC Neo 50 cm AR 12,8 umožnila zkrácení doby na 3,55 min při 63 000 destičkách a 350 bar.
• 110 cm µPAC Neo AR 24 poskytla až 350 000 destiček za 60 min při 135 bar.
• Gradientní eluce prokázala, že kapacita špiček (nC) se zvyšuje s druhou odmocninou délky kolony (nC ≈ √L).
• Porovnání s 25 cm pulled-tip kolonkou ukázalo až 19 % nárůst počtu identifikovaných proteinů a 16 % peptidů při vyšších gradientních délkách.
• Ramping průtoku (750 → 250 nL/min) kombinuje vysokou rychlost s citlivostí, což zrychluje analýzu bez ztráty rozlišení.
• 110 cm µPAC Neo dosáhla hlubokého pokrytí proteomu (µg lyzátu) a stabilní výkon (>480 injekcí) v režimu DDA s variabilitou ±5 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení doby analýzy a zvýšení počtu destiček při středních provozních tlacích usnadňuje vysokopropustné proteomické workflow.
• Vysoká stabilita a reprodukovatelnost kolonek podporuje dlouhodobé kvantitativní studie.
• Flexibilita provozu (isokratická i gradientní eluce, různé průtoky) zajišťuje široké využití v biomedicíně i průmyslové QA/QC.
• Easy-spray připojení nanoViper™ zjednodušuje manipulaci v nanoLC–MS nastavení.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace pilířkové matrice pro ultracitlivé aplikace s subnanolitrovými průtoky.
• Integrace s multiplexními kvantitativními metodami (TMT, DIA) pro rozsáhlé proteomické studie.
• Využití v klinické a farmaceutické analýze pro screening biomarkerů a QC léčiv.
• Vývoj modulárních kolonek kombinujících různé stacionární fáze a AR formáty pro cílené separace.

Závěr

Optimalizované pilířkové kolony µPAC GEN2 a Neo s vysokým poměrem výšky drážek přinášejí výrazné zlepšení chromatografické účinnosti při středních tlacích, kratší časy analýzy, vyšší průtokovou flexibilitu a vynikající stabilitu. Kombinace těchto vlastností z nich činí silný nástroj pro hlubokou proteomickou analýzu.

Reference

Op de Beeck J., Van Landuyt N., Bergen D., Huguet R., Silveira J., Sun X., Robson B., Jacobs P. High aspect ratio pillar array columns for deep proteome profiling at moderate LC pump pressures. Thermo Scientific white paper, September 2022.