Getting started with μPAC Neo HPLC columns

Význam tématu

V oblasti proteomické analýzy hraje klíčovou roli schopnost vysoce reprodukovatelně a citlivě separovat peptidy v nízkých nano­litrových průtocích. Microfabricované mikropillarové sloupce µPAC Neo nabízejí díky preciznímu uspořádání pórů vysoké rozlišení, nižší tlak a větší robustnost než klasické plně pórovité kolonky.

Cíle a přehled studie / článku

Článek popisuje podrobný návod k instalaci a optimalizaci provozu Thermo Scientific™ µPAC™ Neo HPLC sloupců na platformě Vanquish™ Neo UHPLC. Obsahuje doporučené postupy pro dvě hlavní konfigurace: přímou injekci (direct injection) a režim trap-and-elute. Součástí jsou i parametry gradientů, příprava systému a tipy k maximalizaci výkonnosti při analýze mikrogramových i subnanogramových vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

V experimentech byla kombinována následující instrumentace:

• Vanquish™ Neo UHPLC systém v nano/cap konfiguraci
• µPAC™ Neo analytické sloupce (50 cm a 110 cm, včetně low-load verze)
• µPAC™ Neo a konvenční µPAC™ trap kolony (C8/C18) i PepMap™ trap kolona pro vyšší vzorkové zatížení
• Thermo Scientific™ nanoViper™ kapiláry (20 µm I.D.) a MP35N Viper unie
• Thermo Scientific™ EASY-Spray™ Nano Emitter s integrovanou vysokonapěťovou spojkou

Metodika zahrnuje:

• Přípravu a kondicionování sloupců (1,5 kolonních objemů ekvilibrace při 400 bar nebo online při vysokém průtoku)
• Direct injection workflow: injekce vzorku 0,05–5 µL při tlaku až 400 bar, gradienty 15–240 min
• Trap-and-elute workflow: záchyt a odsolení vzorku na trap kolonu při 20–200 µL/min, následná gradientová separace na analytické koloně
• Optimalizaci gradientů a proměnlivého průtoku pro zkrácení doby analýzy a zvýšení citlivosti

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání µPAC Neo a první generace µPAC ukázalo redukci šířky vrcholu o 10–20 % a výrazné zvýšení chromatografického rozlišení. Bakčí tlak zůstal pod 450 bar i při průtocích až 750 nL/min. Při použití proměnného průtoku (např. 750→250 nL/min) se dosáhlo vyšší produkce identifikací proteinu při kratších gradientech (20 min). Trap-and-elute konfigurace prokázala robustní odstranění nečistot a vyšší využití MS (80–95 %).

Přínosy a praktické využití metody

Výhody implementace µPAC Neo sloupců:

• Vynikající reprodukovatelnost v nanoLC–MS/MS
• Možnost analýzy velmi malých vzorků (subnanogramové hladiny)
• Zvýšená propustnost laboratoře díky zkráceným gradientům a rychlé ekvilibraci
• Volba režimu direct injection pro čisté vzorky a trap-and-elute pro vzorky s vysokým obsahem solí/detergentů

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším směrem jsou adaptivní gradienty a průtokové profily řízené podle složení vzorku, integrace s iontovou mobilitou a rozšíření do single-cell proteomiky. Superficiálně pórovité a nepórovité mikrostrukturální sloupce nabízejí platformu pro ultra-rychlé a vysoce citlivé proteomické mapování vzácných biologických vzorků.

Závěr

Thermo Scientific™ µPAC™ Neo sloupce na Vanquish™ Neo UHPLC systému poskytují robustní a vysoce výkonné separace pro nanoLC–MS/MS aplikace. Vyšší rozlišení, nižší tlak a flexibilita workflow umožňují hlubší proteomické pokrytí i při omezeném množství vzorku.

Reference

1. Stejskal K. et al. Ultrasensitive NanoLC-MS of Subnanogram Protein Samples Using Second Generation Micropillar Array LC Technology with Orbitrap Exploris 480 and FAIMS PRO. Anal Chem. 2021.
2. Zheng R. et al. Fast, Sensitive, and Reproducible Nano- and Capillary-Flow LC-MS Methods for High−throughput Proteome Profiling Using the Vanquish Neo UHPLC System Hyphenated with the Orbitrap Exploris 480 MS. Thermo Fisher Scientific Technical Note TN000138.
3. Stejskal K. et al. Deep Proteome Profiling with Reduced Carryover Using Superficially Porous Microfabricated NanoLC Columns. Anal Chem. 2022.