High aspect ratio pillar array columns for deep proteome profiling at moderate LC pump pressures (ASMS)

Význam tématu

Hloubková charakterizace proteomu pomocí kapalinové chromatografie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) umožňuje identifikaci a kvantifikaci tisíců proteinů z komplexních biologických vzorků.
Optimalizace chromatografického rozlišení za středních provozních tlaků usnadňuje rychlé a citlivé analýzy, snižuje dobu analýzy i opotřebení přístrojového vybavení.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout a otestovat nový formát GEN2 mikropilířkové chromatografické kolony s vysokým poměrem výšky k mezipilířové vzdálenosti (aspect ratio) pro zlepšení rozlišení a proteomického pokrytí při „umírněných“ tlacích.
Autoři porovnali výkon prototypů o různých délkách a aspect ratio, a vyhodnotili dopad na kapacitu píků, proteomové pokrytí a provozní flexibilitu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byly použity standardní trávené digestáty (HeLa, Cytochrome C, retenční kalibrace).
Chromatografii prováděl systém Thermo Scientific™ Ultimate™ 3000 nanoRSLC s UV detekcí (3 nL flow-cell) nebo v hyphenaci na MS.
Hmotnostní spektrometrie:

• Thermo Scientific™ TSQ™ Vantage (triple quadrupole) pro SRM testy
• Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos s FAIMS Pro a EASY-Spray zdrojem pro proteomické demonstrace

Data zpracováno pomocí Chromeleon™ (UV), Skyline (SRM) a Proteome Discoverer v2.5 se Sequest HT a Percolator (HR-DDA, 1 % FDR).

Hlavní výsledky a diskuse

Vysoký aspect ratio GEN2 pilířkové kolony o délce 50 a 110 cm dosahují teoretické kapacity píků až 1736 (FWHM) při provozních tlacích do 400 bar.
Snížením mezipilířové vzdálenosti na polovinu se tlak zvyšuje čtyřnásobně, ale díky optimálnímu tvaru sloupce zůstávají experimentální a teoretické hodnoty v souladu.
V proteomických experimentech se zvýšením délky gradientu (70–240 min) a sample load (200–4000 ng) dosáhli až 8603 identifikovaných skupin proteinů v jednom DDA běhu.
Zapojení FAIMS Pro zvyšuje proteomové pokrytí o 25–35 % (proteinové skupiny) a 40 % (peptidové skupiny).
Snížení cyklu MS z 3 s na 1 s přidalo až 50 % více ID při krátkých gradientech.

Přínosy a praktické využití metody

Nové pilířkové kolony umožňují:

• Vyšší průtoky se zachovaným rozlišením, kratší doby analýz
• Délky až 110 cm bez nepřiměřeného nárůstu tlaku
• Spolehlivou integraci s FAIMS a různými ESI emitery
• Vylepšené hluboké proteomové profilování s vyšší identifikací proteinů i peptidů

Vhodné pro výzkumné i QA/QC laboratoře zabývající se komplexními biologickými vzorky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další optimalizace geometrie pilířků a materiálů povrchů mohou posunout rozlišení i citlivost ještě výše.
Integrace s vysoce rychlými HRAM přístroji a dia metodami otevře cestu ke kvantitativnímu screeningům.
Vývoj kompaktnějších high-throughput formátů (např. 15–60 min gradienty) pro rutinní aplikace.

Závěr

GEN2 mikropilířkové kolony s vysokým aspect ratio nabízejí výrazně lepší chromatografické vlastnosti než konvenční balené kolony a při střídmých tlacích podporují hluboké proteomické analýzy.
Flexibilita v délce a provozních podmínkách umožňuje škálovat metodu od rychlých až po extrémně hloubkové experimenty.

Reference

1. J.R. Mazzeo et al., Journal of the American Chemical Society, 2005, 460–467.
2. K. Broeckhoven, G. Desmet, Analytical Chemistry, 2021, 257–272.
3. U.D. Neue, Journal of Chromatography A, 2005, 153–161.
4. A.S. Hebert et al., Analytical Chemistry, 2018, 9529–9537.