High aspect ratio pillar array columns for deep proteome profiling at moderate LC pump pressures

Význam tématu

Trvalé zvyšování rozlišovací schopnosti kapalinové chromatografie (LC) je klíčové pro hlubokou charakterizaci proteomu. V proteomických analýzách závisí citlivost a kvalita identifikací na kombinaci chromatografické separace a hmotnostní spektrometrie (HRAM MS). Mikrostrukturované pilířkové kolony µPAC Neo s vysokým poměrem stran přinášejí zvýšenou rozlišovací schopnost při zachování příznivých provozních tlaků.

Cíle a přehled studie

Autoři představili novou generaci mikro pilířkových kolonek µPAC Neo s mezipilířkovou vzdáleností 1,25 µm a poměrem stran až 24. Studie hodnotila hydraulickou permeabilitu, provozní tlaky, kapacitu špiček (peak capacity) a proteomické pokrytí při použití různých délek (50 cm, 110 cm) a průtoků v nanolitražních režimech. Kolony byly testovány jak samostatně s UV detekcí, tak v hyphenovaných LC-MS konfiguracích.

Použitá metodika a instrumentace

Ultrachromatografický systém Thermo Scientific™ Ultimate 3000 RSLC nano byl používán s µPAC Neo kolonkami (50 cm, 110 cm). MS detekce proběhla na Thermo Scientific™ TSQ Vantage triple kvadrupólu a na Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion Lumos s FAIMS pro a EASY-Spray Bullet Emitterem (10 µm). Příprava vzorků zahrnovala standardy Thermo Scientific™ Pierce™ HeLa digest a cytochrom C. Data zpracovávaly softwary Chromeleon, Skyline a Proteome Discoverer s využitím Sequest HT, Percolator a databáze SwissProt.

Hlavní výsledky a diskuse

Experimentálně bylo potvrzeno, že zvýšení poměru stran pilířků z 2,4 na 24 snižuje zpětný tlak až třikrát při zachování průtokových vlastností.

• Kapacita špiček dosahovala až 1736 (FWHM).
• Proteomické pokrytí se oproti baleným kolonám zvýšilo o 10 % na úrovni proteinových skupin a 47 % na úrovni peptidových skupin při vazbě na Orbitrap Fusion Lumos s FAIMS.
• Optimální MS cykly 1 s zvýšily počet ID až o 50 % pro krátké gradienty.
• Single-shot 4 h analýza umožnila identifikovat až 9424 proteinových skupin.

Přínosy a praktické využití metody

Mikro pilířkové kolony µPAC Neo nabízejí:

• Větší provozní flexibilitu – od rychlých až po dlouhé gradienty.
• Nižší spotřebu vzorku při vysokém rozlišení.
• Snížené carry-over díky povrchové porozitě pilířků.
• Zvýšenou hloubku proteomické analýzy bez nutnosti frakcionace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj se zaměří na integraci iontově-mobilitních separací, zvýšení délky kolonek za přijatelných tlaků a rozšíření aplikací do metabolomiky a lipidomiky. Pokročilé mikro- a nanofluidní systémy a AI-řízená optimalizace chromatografie dále posílí výkonnost a robustnost analytických postupů.

Závěr

Redesign µPAC Neo pilířkových kolon přinesl významné zlepšení chromatografické rozlišovací schopnosti a proteomického pokrytí při zachování přijatelného provozního tlaku. Mikrostrukturované separační vrstvy se ukazují jako perspektivní alternativa k tradičním baleným kolonám pro náročné proteomické studie.

Reference

1. J.R. Mazzeo, U.D. Neue, M. Kele, R.S. Plumb, W. Corp, J. Am. Chem. Soc., 2005, 460–467.
2. K. Broeckhoven, G. Desmet, Anal. Chem., 2021, 93, 257–272.
3. U.D. Neue, J. Chromatogr. A, 2005, 1079, 153–161.
4. A.S. Hebert et al., Anal. Chem., 2018, 90, 9529–9537.