PAMS: AUTOMATED WORKFLOWS FOR INTACT MASS, PURITY AND SEQUENCE CONFIRMATION OF OLIGONUCLEOTIDES

Význam tématu

Syntetické oligonukleotidy představují klíčové nástroje pro moderní léčiva díky vysoké specifitě a nízké toxicitě.
Analýza jejich integrity, čistoty a sekvence je nezbytná pro zajištění kvality a bezpečnosti terapeutických produktů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vytvořit automatizovaný a uživatelsky přívětivý pracovní postup spojující měření intaktní hmotnosti, výpočet čistoty a potvrzení sekvence oligonukleotidů.
Workflow je kompatibilní s regulovanými i neregulovanými laboratořemi a využívá aplikace INTACT Mass a CONFIRM Sequence.

Použitá metodika a instrumentace

• LC-MS platforma BioAccord a Xevo G2-XS QTof v negativním ESI režimu.
• Chromatografie na UPLC ACQUITY Premier OST koloni (2.1 × 100 mm) s gradientem 25–35 % organické fáze za 25 min při 60 °C.
• Mobilní fáze obsahující TEA a HFIP v různých poměrech pro optimální separaci.
• Detekce UV při 260 nm pro výpočet čistoty jednotlivých složek.
• BayesSpray dekonvoluční algoritmus pro rychlé zpracování spektar.
• CID a MSE fragmentace pro získání MS/MS dat a potvrzení sekvence.

Hlavní výsledky a diskuse

• Analýza 21-meru s 19 modifikacemi 2’-OMe prokázala přesnost měření intaktní hmotnosti pod 10 ppm.
• Detekováno a vyhodnoceno 11 nečistot, přičemž nejnižší relativní abundance byla 0,2 %.
• Aplikace CONFIRM Sequence dosáhla 100 % sekvenčního pokrytí pro hlavní produkt a až 95 % pro nejobtížnější nečistoty.
• Workflow umožnil lokalizovat vynechané modifikace v konkrétních pozicích oligonukleotidu.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizované dekonvoluce a rychlý přístup k výsledkům intaktní hmotnosti a čistoty.
• Spolehlivá detekce a sekvenční potvrzení i u stopových nečistot.
• Standardizované aplikace waters_connect vhodné pro QA/QC procesy v průmyslu i výzkumu.
• Možnost rozšíření metodiky na další typy modifikovaných nukleových kyselin (siRNA, mRNA).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace umělé inteligence pro automatizovanou interpretaci MS/MS dat a rychlejší rozhodování.
• Nasazení vysokorychlostních TOF/QTOF systémů pro zvýšení propustnosti vzorků.
• Vybudování databází modifikovaných oligonukleotidů pro pokročilou identifikaci neznámých nečistot.
• Rozšíření workflow na komplexní biologické vzorky a klinické aplikace.

Závěr

Popsaný automatizovaný workflow spojuje aplikace INTACT Mass a CONFIRM Sequence k efektivnímu stanovení hmotnosti, čistoty a sekvence oligonukleotidů. Výsledný postup nabízí vysokou citlivost, rychlost a reprodukovatelnost, což jej předurčuje pro rutinní analýzy v regulovaných i neregulovaných prostředích.

Reference

1. Sharma VK, Watts JK. Oligonucleotide therapeutics: chemistry, delivery and clinical progress. Future Med Chem. 2015;7(16):2221–2242.
2. McLukey SA, Van Berkel GJ, Glish GL. Tandem Mass Spectrometry of Small, Multiply Charged Oligonucleotides. J Am Soc Mass Spectrom. 1992;3:60–70.
3. Waters application note P/N 720006820EN. An Automated Compliance-Ready LC-MS Workflow for Intact Mass Confirmation and Purity Analysis of Oligonucleotides. 2020.
4. Waters application note P/N 720007028EN. Intact Mass Confirmation Analysis on the BioAccord LC-MS System for a Variety of Extensively Modified Oligonucleotides. 2020.
5. Waters application note P/N 720007301EN. Analysis of Oligonucleotide Impurities on the BioAccord System with ACQUITY Premier. 2021.
6. Waters application note P/N 720007546EN. LC-MS Analysis of siRNA, Single Guide RNA and Impurities using the BioAccord System with ACQUITY Premier System and New Automated INTACT Mass Application. 2022.
7. Waters application note P/N 720007677EN. CONFIRM Sequence: A waters_connectTM Application for Sequencing of Synthetic Oligonucleotides and Their Impurities. 2022.