CONFIRM Sequence: A waters_connect Application for Sequencing of Synthetic Oligonucleotides and Their Impurities

Význam tématu

Oligonukleotidy představují rychle se rozvíjející sektor terapeutik, který vyžaduje přesnou a citlivou analýzu struktur a nečistot. Pro udržení biologické aktivity je klíčové potvrdit správnou sekvenci celého řetězce i přítomnost nízkonivových vedlejších produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem je ukázat automatizovaný LC-MS pracovní postup využívající aplikaci CONFIRM Sequence v prostředí waters_connect. Studie demonstruje rychlou a spolehlivou interpretaci komplexních MS/MS a MSE dat s dosažením 100 % sekvenčního pokrytí u hlavního produktu i u nečistot přítomných již od 0,2 %.

Použitá metodika a instrumentace

• LC-MS systém: Xevo G2-XS QTof spojený s H-Class Bio UPLC.
• Kolona: ACQUITY Premier OST C18, 1,7 µm, 2,1×100 mm.
• Metodika: ion pairing reverzní fáze s HFIP/TEA v mobilních fázích, separace při 60 °C, průtok 300 µL/min.
• Detekce: negativní ESI, full scan m/z 500–5000, cílené MS/MS s fixním collision energy (5–70 V) a data-independent MSE s náběhem energie.
• Software: waters_connect pro akvizici, CONFIRM Sequence pro automatické sestavení a analýzu sekvence.

Hlavní výsledky a diskuse

• Aplikace dosahuje 100 % pokrytí sekvence pro 21-mer modifikovaný oligonukleotid při optimalizovaném napětí i pomocí MSE bez nutnosti individuální kalibrace.
• Nízkonivová impurita (11-mer, 0,2 %) byla také potvrzena se 100 % pokrytím, což dokládá citlivost metody.
• Detekovány byly různé třídy nečistot: zkrácené řetězce, sekvenční izomery a deaminační produkty.
• Dot-map vizualizace usnadňuje rychlé zhodnocení dat a lokalizaci modifikací či chyb v syntéze.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy díky automatizované interpretaci spekter.
• Compliance-ready prostředí vhodné pro QA/QC v farmaceutickém vývoji.
• Schopnost odhalit a potvrdit i nízké koncentrace nečistot, kritické při výrobě terapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace rozšířených knihoven modifikovaných nukleotidů a umělé inteligence pro ještě rychlejší analýzu.
• Adaptace pro dlouhé RNA, mRNA a další nukleové kyseliny s různými modifikacemi.
• Rozšíření na plně datově nezávislou akvizici (DIA) ve vysokoprocesorovém režimu.

Závěr

Automatizovaná aplikace CONFIRM Sequence nabízí spolehlivé a úplné sekvenční potvrzení syntetických oligonukleotidů a jejich impurit. Metoda kombinuje fixní collision energy i MSE, dosahuje 100 % pokrytí a podporuje efektivní QA/QC workflow.

Reference

1. Sharma VK, Watts JK. Oligonucleotide therapeutics: chemistry, delivery and clinical progress. Future Med Chem. 2015;7(16):2221-2242.
2. Roberts TK, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19:673-694.
3. Pourshahian S. Therapeutic oligonucleotides, impurities, degradants, and their characterization by mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 2019;00:1-35.
4. Obika S, Sekine M, eds. Synthesis of therapeutic oligonucleotides. 1st ed. Springer; 2018.
5. Capaldi D et al. Impurities in oligonucleotide drug substances and drug products. Nucleic Acid Ther. 2017;27:309-322.
6. Waters Application Note. Automated compliance-ready LC-MS workflow for intact mass confirmation. 2020.
7. Waters Application Note. Intact mass confirmation analysis on the BioAccord system. 2020.
8. Waters Application Note. Analysis of oligonucleotide impurities on the BioAccord system. 2021.
9. Waters Application Note. LC-MS analysis of siRNA, sgRNA and impurities with BioAccord. 2022.
10. McLukey SA, Van Berkel GJ, Glish GL. Tandem mass spectrometry of small, multiply charged oligonucleotides. J Am Soc Mass Spectrom. 1992;3:60-70.
11. Rozenski J, McCloskey J. SOS: ab initio oligonucleotide sequencing by mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 2002;13:200-203.
12. Oberacher H et al. Automated comparative sequencing of long-chain oligonucleotides. J Am Soc Mass Spectrom. 2004;15:510-522.
13. Kretschmer M et al. Algorithm for sequence confirmation of modified oligonucleotides by MS. Anal Biochem. 2010;405:213-223.
14. Nakayama H et al. Ariadne: search engine for RNA analysis using tandem MS. Nucleic Acids Res. 2009;37:1-13.
15. Yang J et al. Design of an oligonucleotide mass calculation program. J Am Soc Mass Spectrom. 2013;24:1315-1318.
16. Nyakas A et al. OMA and OPA software for nucleic acids MS. J Am Soc Mass Spectrom. 2013;24:249-256.
17. Rozenski J. Mongo oligo mass calculator. Accessed 2022.
18. Kass I. Spectrum Tools. 2018.
19. Rentel C et al. Determination of oligonucleotide deamination by high resolution MS. J Pharm Biomed Anal. 2019;173:56-61.