CONFIRM Sequence - A NEW SOFTWARE TOOL FOR SEQUENCE CONFIRMATION AND IMPURITY ANALYSIS OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES

Význam tématu

Analýza syntetických oligonukleotidů vyžaduje vysoce citlivé a selektivní metody pro detekci a potvrzení jejich sekvence a přítomnost stopových nečistot. Vývoj nových softwarových nástrojů urychluje interpretaci MS/MS a MSE dat a zvyšuje efektivitu jak regulačně orientovaných, tak výzkumných laboratoří.

Cíle a přehled studie / článku

Článek představuje nový softwarový modul CONFIRM Sequence určený k rychlé lokalizaci a identifikaci sekvenčních odchylek a nečistot syntetických oligonukleotidů. Autoři demonstrují jeho schopnosti na 21-meru s 2’-OMe modifikacemi, včetně analýzy nízkopropočtových nečistot.

Použitá metodika a instrumentace

• Separace metodou ion-pair reverzní fáze (IP-RP) s využitím TEA/HFIP pufrů, gradient 25–35 % B během 25 min.
• MS detekce v negativním režimu ESI na rozsahu m/z 500–5 000, plný scan 1 Hz, zdrojová teplota 120 °C, desolvační 450 °C.
• Fragmentace CID s pevnou kolizní energií optimalizovanou softwarem (10–70 V pro různá prekurzorová nabití).
• Instrumentace: Waters ACQUITY H-Class Bio UPLC, ACQUITY Premier OST column 2.1×100 mm, Waters Xevo G2-XS QTof.

Hlavní výsledky a diskuse

Software CONFIRM Sequence poskytl vysokou sekvenční pokrytí (100 % pro FLP, >75 % pro osm nečistot). Dokázal jednoznačně určit umístění chybějící modifikované báze v 20-meru s 80 % pokrytím. Analýza nečistot s relativní abundancí až 0,2 % dosahovala až 95 % pokrytí. Výsledky ukazují robustnost workflow i pro stopovou analýzu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá validace sekvence syntetických oligonukleotidů v regulovaných i výzkumných laboratořích.
• Vysoce citlivá detekce a lokalizace nečistot i v nízkých hladinách.
• Automatizace interpretace MS/MS a MSE dat s grafickým výstupem a statistickou podporou.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace CONFIRM Sequence do komplexních QC workflow spolu s online nástroji pro design a kontrolu kvality oligonukleotidů. Rozšíření podpory pro další typy modifikací a aplikace v genové terapii či diagnostice. Využití strojového učení pro přediktivní analýzu sekvenčních odchylek.

Závěr

Představený software CONFIRM Sequence v kombinaci s IP-RP LC-MS představuje efektivní a spolehlivou technologii pro potvrzení sekvence a detailní analýzu nečistot syntetických oligonukleotidů. Dosahované vysoké sekvenční pokrytí i u stopových látek potvrzuje přínos této metody pro farmaceutický vývoj i výzkum.

Reference

1. Sharma VK, Watts JK Oligonucleotide therapeutics: chemistry, delivery and clinical progress, Future Med Chem, 2015, 7(16), 2221-2242.
2. An Automated Compliance-Ready LC-MS Workflow for Intact Mass Confirmation and Purity Analysis of Oligonucleotides, Waters application note, P/N 720006820EN, 2020.
3. Intact Mass Confirmation Analysis on the BioAccord LC-MS System for a Variety of Extensively Modified Oligonucleotides, Waters application note, P/N 720007028EN, 2020.
4. Analysis of Oligonucleotide Impurities on the BioAccord System with ACQUITY Premier, Waters application note, P/N 720007301EN, 2021.
5. LC-MS Analysis of siRNA, Single Guide RNA and Impurities using the BioAccord System with ACQUITY Premier System and New Automated INTACT Mass Application, Waters application note, P/N 720007546EN, 2022.
6. McLukey SA, Van Berkel GJ, Glish GL Tandem Mass Spectrometry of Small, Multiply Charged Oligonucleotides, J Am Soc Mass Spectrom, 1992, 3, 60-70.