A WORKFLOW FOR PURITY DETERMINATION, INTACT MASS MEASUREMENT AND MS/MS SEQUENCING OF OLIGONUCLEOTIDE IMPURITIES DETECTED IN SYNTHETIC OLIGOS

Význam tématu

Syntetické oligonukleotidy jsou klíčové v moderní medicíně i biovědě, avšak jejich účinnost a bezpečnost závisí na vysoké čistotě a přesné identifikaci možných nečistot.

• Zajištění kvality a reprodukovatelnosti snižuje riziko nespecifických účinků.
• Regulační požadavky vyžadují detailní sledování a dokumentaci nečistot.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo implementovat automatizovaný workflow pro stanovení čistoty, měření intact mass a rychlé sekvenování nečistot v syntetických oligonukleotidech pomocí UPLC-MS a softwaru waters_connect. Metodika je vhodná pro regulovaná i neregulovaná laboratoře, s důrazem na rychlost, přesnost a úplné pokrytí sekvence.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: Ion-pairing UPLC na ACQUITY Premier OST kolonce s mobilními fázemi TEA/HFIP.
• Detekce: UV (260 nm) a negative ESI-MS na Xevo G3 QTof.
• Fragmentace: CID (10–70 V) a MSE pro data independent acquisition.
• Software: INTACT Mass App pro dekonvoluci intact mass, CONFIRM Sequence App pro MS/MS analýzu a statistiku pokrytí sekvence.
• Vzorek: 21-mer oligonukleotid s devíti modifikacemi 2’-MOE a 5-Me na bázi uridinu a cytidinu.

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow identifikoval 16 různých nečistot s relativními abundancemi od 0,05 % až po full length product (FLP).

• Mass accuracy intact mass měření byla lepší než 10 ppm pro všechny analyzované komponenty.
• MS/MS pokrytí sekvence dosáhlo přes 94 % u FLP a 83 % u nejméně zastoupené nečistoty (0,05 % rel. abundance).
• Automatizované zpracování umožnilo rychlou lokalizaci modifikací a přesnou analýzu nečistot.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a automatizovaná kontrola kvality syntetických oligonukleotidů ve farmaceutickém průmyslu.
• Podpora výzkumných laboratoří i QA/QC oddělení v biotechnologických firmách.
• Kompatibilita s regulačními normami díky detailní dokumentaci nečistot a vysoké reproducibilitě.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace umělé inteligence pro prediktivní detekci nečistot a optimalizaci workflow.
• Rozšíření metodiky na delší a komplexně modifikované RNA jednořetězce či možnost multiplexních analýz.
• Prepojení se systémy LIMS pro centrální správu dat a zajištění plné auditní stopy.

Závěr

Navržený LC-MS/MS workflow s aplikacemi INTACT Mass a CONFIRM Sequence poskytuje robustní, citlivou a plně automatizovanou platformu pro stanovení čistoty a sekvenování nečistot syntetických oligonukleotidů s vysokou přesností a pokrytím sekvence.

Reference

• An Automated Compliance-Ready LC-MS Workflow for Intact Mass Confirmation and Purity Analysis of Oligonucleotides, 2020, Waters application note, P/N 720006820EN
• Analysis of Oligonucleotide Impurities on the BioAccord System with ACQUITY Premier, 2021, Waters application note, P/N 720007301EN
• LC-MS Analysis of siRNA, Single Guide RNA and Impurities using the BioAccord System with ACQUITY Premier System and New Automated INTACT Mass Application, 2022, Waters application note, P/N 720007546EN
• CONFIRM Sequence: A waters_connect Application for Sequencing of Synthetic Oligonucleotides and Their Impurities, 2022, Waters application note, P/N 720007677EN