Thermo Scientific μPAC HPLC Column robustness in bottom-up proteomics

Význam tématu

Liquid chromatography – mass spectrometry (LC-MS) je základní nástroj v bottom-up proteomice, kde je spolehlivost chromatografických kolon klíčová pro kontinuitu a kvalitu dat. Časté selhávání klasických balených kolon vede ke značnému prostoji laboratoří, prodlužuje dobu analýz a zvyšuje náklady na údržbu.

Cíle a přehled studie

Cílem technické poznámky bylo ověřit dlouhodobou životnost a odolnost 200 cm mikro pilířové µPAC HPLC kolony při standardních podmínkách bottom-up proteomiky. Studie zahrnovala až 6 měsíců kontinuálního provozu, celkem 3 526 injekcí, včetně 1 000 injekcí HeLa digestu a třech sad „náročných“ vzorků obsahujících zbytky detergentů či nerozpustný precipitát.

Použitá metodika a instrumentace

• Kolona Thermo Scientific™ µPAC™, délka 200 cm, pillar spacing 2,5 µm
• Mobilní fáze A: H2O + 0,1 % TFA; B: 80 % acetonitril + 0,1 % TFA
• Gradient 1–50 % B v 30 min; průtok 1 µL/min; teplota kolony 35 °C
• Detekce UV při 214 nm; injekční objem 1 µL

Hlavní výsledky a diskuse

Po 6 měsících provozu a 1 000 injekcích HeLa digestu byla u referenčního Cytochrome C digestu zaznamenána vynikající stabilita retenčních časů (< 2 % CV), konstantní šířka špiček a asymetrie i stabilní zpětný tlak (~ 235 bar, 3 % CV). Total flush čítal 21 707 kolonych objemů bez náznaku ucpání či zhoršení výkonu.
Pro demonstraci odolnosti vůči kontaminaci byly vyhodnoceny tři sady vzorků: obsahující zviřovací detergent Triton X-114, rostlinný lytický detergent NP-40 a vzorky s nerozpustným precipitátem. Po každé z šesti injekcí náročných vzorků následovaly referenční běhy Cytochrome C digestu. Nebyl pozorován nárůst kolonního tlaku, změna retenčních časů ani šířky špiček, což potvrzuje vyloučení ucpávání a minimální matrice efekt.

Přínosy a praktické využití metody

µPAC kolony s mikropilíři nabízejí extrémně nízkou disperzi (eliminace A-terminu), ostré peaky a výrazně nižší zpětný tlak než sub-2 µm částicové kolony. To umožňuje použití velmi dlouhých kolon pro vysokou separační účinnost a minimalizuje riziko selhání při práci s komplexními, „špinavými“ vzorky bez nutnosti časté výměny.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj mikrofluidní nano-LC podporuje integraci µPAC kolony s ultrarychlými gradienty a vysoce citlivými mass analyzátory. Perspektivní je využití v klinické proteomice, farmaceutické kontrole kvality a multi-omics aplikacích, kde robustnost a reprodukovatelnost separací zvyšují spolehlivost dat.

Závěr

Thermo Scientific µPAC 200 cm kolona prokázala vynikající životnost a odolnost při standardních bottom-up podmínkách i náročných vzorcích. Bez zhoršení chromatografických parametrů přečkala 6 měsíců a tisíce injekcí, což výrazně snižuje dobu výpadků LC-MS systému a náklady na údržbu.

Reference

• W. De Malsche et al., Anal. Chem. 80 (2008) 5391–5400
• W. De Malsche et al., Anal. Chem. 84 (2012) 1214–1219
• P. Feist, A. B. Hummon, Int. J. Mol. Sci. 16 (2016) 3537–3563
• J.-Y. Zhou et al., Anal. Chem. 84 (2012) 2862–2867