Thermo Scientific μPAC Flex iON Connect ESI-MS interface

Význam tématu

V oblasti nano- a kapilární kapalné chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií (nanoLC-MS) je klíčové minimalizovat mrtvé („dead“) objemy za kolonou. I drobné nesrovnalosti ve spojích mohou významně zhoršit separační výkon a citlivost analýzy. Proto je potřeba uživatelsky přívětivého a zároveň vysokovýkonného řešení pro rychlé a reprodukovatelné propojení nanoLC kolon s ionizačním zdrojem MS.

Cíle a přehled studie

Technická poznámka popisuje vývoj, konstrukci a ověření rozhraní Thermo Scientific µPAC Flex iON Connect ESI-MS Interface určeného pro spolehlivé spojení µPAC nanoLC kolon s Nanospray Flex iontovými zdroji. Hlavním cílem je snížit počet post-kolonových spojů, minimalizovat mrtvá objemová místa a dosáhnout stabilního nanoelectrospraye při průtocích až do 1500 nL/min.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific µPAC Flex iON Connect ESI-MS Interface (docking unit + spray unit)
• Thermo Scientific DirectJunction adaptér pro Nanospray Flex Series iontové zdroje
• 50 cm µPAC nanoLC kolona (reverzní fáze)
• Vysokorozlišovací hmotový analyzátor připojený k Nanospray Flex Series zdroji
• HeLa buněčný digest standard se 15 retenčními peptidy (PRTC)
• UV detekční cely pro hodnocení kvality spojů (cytochrom c digest)

Použitá metodika

Sestava rozhraní sestává ze dvou dílů vyrobených aditivní technologií z polyamidu: docking unit pro uchycení na DirectJunction kovovou tyč iontového zdroje (připojení high voltage a grounding kabelů) a spray unit se dvěma vodivými redukčními spojkami propojenými kouskem křemenné kapiláry (360 µm OD, 20 µm ID). Montáž zahrnuje:

• Nasazení docking unit na DirectJunction adaptér a jednorázové připojení HV a uzemňovacích kabelů
• Instalaci spray unit s emitorem (kompatibilní 360 µm OD) do docking unit uchyceného magneticky
• Volbu vhodných emitter tipů (10–30 µm) podle průtoku: menší ID pro nízké průtoky (50–500 nL/min), větší pro vyšší (500–1500 nL/min)
• Nastavení počátečního napětí v rozsahu 1,0–1,5 kV a postupné zvyšování po 0,1 kV pro optimalizaci stability spreje

Hlavní výsledky a diskuse

• Snížení počtu spojů ze čtyř na dva významně omezilo mrtvé objemy a zlepšilo symetrii špiček a intenzitu signálu.
• Optimální sprej byl dosažen při napětích 1,7–2,5 kV pro průtoky 250 a 500 nL/min, při stabilním proudu 1–1,4 µA.
• 24hodinová série nanoLC-MS běhů na 50 cm µPAC kolonu s PRTC peptidy prokázala run-to-run variabilitu CV 7,15 % v ploše špiček a konzistentní retenční časy.
• Bottom-up proteomika (100 ng/µL HeLa digest) přinesla přes 1000 identifikovaných proteinových skupin v 24 bězích 60min gradientu, s průměrnou šířkou špičky (FWHM) stabilní kolem 6 s.
• Studie vlivu operátora prokázala, že rozhraní je odolné vůči lidské chybě: operátoři od experta po začátečníka dosáhli podobné kvality UV chromatogramů, šířky a asymetrie špiček.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a opakovatelná montáž redukuje čas přípravy a proměnlivost výsledků.
• Minimalizace mrtvých objemů zvyšuje rozlišení a citlivost nanoLC-MS analýz.
• Systém je kompatibilní s libovolnými 360 µm OD emitery a µPAC kolonami, vhodný pro proteomiku, metabolomiku i farmaceutickou analýzu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření kompatibility na další nanoLC-MS platformy a zdroje.
• Automatizace výměny emitter tipů a dálková kontrola HV uzemnění.
• Využití v single-cell proteomice a ultra-nízkomnožstevní analýzách.
• Kombinace s ion mobility separací a dalšími dimenzemi separace.

Závěr

Thermo Scientific µPAC Flex iON Connect ESI-MS Interface nabízí vysoce robustní a uživatelsky přívětivé řešení pro nanoLC-MS s minimálními mrtvými objemy, stabilním electrospraye a vynikající reprodukovatelností výsledků bez ohledu na úroveň zkušenosti operátora.

Reference

1. Dolan J.W., Upchurch P. Troubleshooting LC Fittings, Part I, LC-GC Magazine, 1988, 6, 788–790.
2. Stoll D.R. Fittings and connections for liquid chromatography – so many choices, LCGC North America, 2018, 36, 304–311.
3. Thermo Fisher Scientific. Nanospray Flex Series Ion Source User Guide (Rev. B), 6005397127.
4. Thermo Fisher Scientific. µPAC Flex iON Connect ESI-MS Interface Instructions for Use.
5. PharmaFluidics. Routine proteome analysis using 50 cm µPAC columns, Technical Note 5.