Routine proteome analysis using 50 cm μPAC columns

Význam tématu

Bottom-up proteomika vyžaduje vysokou chromatografickou rozlišovací schopnost k separaci komplexních směsí peptidů. Tradiční sub-2 µm částicové nanoLC kolony poskytují vysoký výkon, ale jsou limitovány tlakem a protečným zátěžím. Technologie µPAC představuje alternativu s perfektně definovanou geometrií pórů, nízkým tlakem a vynikající reprodukovatelností, což je zvláště důležité pro rutinní analýzy s vysokým pracovním nasazením.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo porovnat chromatografický výkon 50 cm µPAC kolony s dvěma 15 cm sub-2 µm částicovými kolonami (dva různí výrobci) při třech gradientních délkách (30, 60, 90 min). Hlavní metriky zahrnovaly bazové stopové chromatogramy, tlaky kolony, šířky pečkových špiček, kapacitu píků a počet identifikovaných proteinových a peptidových skupin.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: 500 ng tryptického digestu HeLa buněk, doplněno PRTC standardem (50 fmol/µl).
Podmínky: přímá injekce 1 µl na koloně, teplota 50 °C, tok 300 nL/min (µPAC i PB) a navíc 1000 nL/min pro µPAC. Gradient: 1–50 % organické fáze v 30, 60 a 90 min.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific µPAC 50 cm kolona
• 15 cm sub-2 µm částicové nanoLC kolony (dva různí výrobci)
• NanoLC systém s přímou injekcí
• Vysokorozlišovací hmotnostní spektrometr (LC–MS/MS)
• Elektrosprayový zdroj s New Objective PicoTip emitorem
• Software Thermo Scientific Proteome Discoverer 2.2

Hlavní výsledky a diskuse

µPAC kolona prokázala nejvyšší bazové intenzity (2,5×10^8 iontů při 300 nL/min) oproti PB kolonám (1,5×10^8). Díky velmi nízkému zpětnému tlaku (40 bar při 300 nL/min, 122 bar při 1000 nL/min) lze výrazně zkrátit dobu analýzy. Průměrné šířky píků 4σ se pohybovaly mezi 0,13–0,22 min pro µPAC vs 0,18–0,33 min pro PB kolony. Vypočtené píkopicové kapacity překročily hodnotu 200 již pro 30 min gradient na µPAC. Při 60 min gradientu bylo na µPAC identifikováno průměrně 1 703 proteinových skupin a 6 132 peptidových skupin, což představuje nárůst ~40 % proteinů a ~60 % peptidů oproti PB kolám.

Přínosy a praktické využití metody

µPAC technologie nabízí vysokou robustnost, vynikající reprodukovatelnost mezi kolony, flexibilitu průtoku 100–2000 nL/min a výrazně nižší zátěž tlaku. To umožňuje zkrácení analýz pod 60 min při zachování či zlepšení separační kapacity, čímž se zvyšuje propustnost laboratoře pro rutinní proteomiku, QA/QC i průmyslové aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj µPAC sloupců s upravenými geometriemi pro ještě vyšší kapacitu. Integrace s datově nezávislou akvizicí (DIA) a automatizovanými platformami rozšíří použití v klinických a vysokopropustných aplikacích. Kombinace s ion-mobility spektrometrií přinese další zlepšení rozlišení komplexních směsí.

Závěr

50 cm µPAC kolona prokázala výrazné zlepšení chromatografického výkonu a proteomické hloubky při nižším provozním tlaku a kratších době běhu ve srovnání s tradičními sub-2 µm částicovými kolony. Technologie poskytuje ideální kompromis mezi vysokou separační kapacitou a provozní efektivitou pro rutinní proteomiku.

Reference

• W. De Malsche, H. Gardeniers, G. Desmet, Experimental Study of Porous Silicon Shell Pillars under Retentive Conditions, Anal. Chem. 80 (2008) 5391–5400
• W. De Malsche et al., Realization of 1×10^6 Theoretical Plates in Liquid Chromatography Using Very Long Pillar Array Columns, Anal. Chem.
• U. D. Neue, Peak capacity in unidimensional chromatography, J. Chromatogr. A 1184 (2008) 107–130