Bottom-up proteomic profiling with μPAC HPLC columns

Význam tématu

Mass spectrometrie založená proteomika vyžaduje vysokou separační výkonost a citlivost při zachování throughput. Bottom-up workflow s kapilárními a mikroflow HPLC kolónami představuje kompromis mezi kvalitou separace a rychlostí analýzy. Thermo Scientific μPAC kolony slibují vyšší robustnost, nižší tlak a lepší retenční stabilitu.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo zhodnotit chromatografický výkon μPAC kapilárních pilířových kolon ve srovnání s konvenčními packed-bed kolonami při bottom-up proteomice. Testován byl 500 ng HeLa tryptického digesu při gradientech 15, 30 a 60 min a průtocích 2,5–10 μL/min.

Použitá instrumentace

• μPAC HPLC kolona: 50 cm délka, 28 μm pilíře
• Packed-bed kolona: 150 × 0,300 mm, 2 μm částice
• Reverzní fáze kapilární LC-MS/MS
• Gradientní eluce v rozsahu 15–60 min

Metodika

Pro každou kolonu proběhly trojité repliky při čtyřech průtocích a třech délkách gradientů. Sledovány byly basepeak chromatogramy, vrcholové šířky (FWHM) 15 PRTC referenčních peptidů, peak capacity, retenční stabilita a identifikace peptidů a proteinů.

Hlavní výsledky a diskuse

• μPAC kolona pracuje při průtocích 1–15 μL/min s minimálním tlakem (max. 350 bar).
• Nejvyšší MS signál a citlivost při 2,5 μL/min díky vyšší in-peak koncentraci a efektivnější ionizaci.
• Vrcholové šířky (FWHM ~0,10–0,11 min) konzistentní napříč všemi průtoky a gradienty.
• Peak capacity >200 v rozmezí gradientů 30–90 min.
• Retenční stabilita μPAC kolony: CV 0,26 % vs. 0,73 % u packed-bed.
• Proteomický výstup: až o 20 % více proteinových skupin a 40 % více peptidů než u packed-bed kolony (7,5 μL/min, 30 min).

Přínosy a praktické využití metody

μPAC kolony nabízejí vyšší propustnost a odolnost proti ucpávání, bez částic a fritů. Nižší tlak a vynikající retenční přesnost zajišťují spolehlivost při vysokopropustných proteomických aplikacích v biomedicínském výzkumu či průmyslové QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj se zaměří na prodloužení pilířových kolon pro ještě vyšší peak capacity a integraci s automatizovanými platformami. Kombinace s DIA metodami a vysokopropustnými formáty otevře cestu k hlubší a rychlejší proteomické analýze.

Závěr

Thermo Scientific μPAC HPLC kolony představují pokrokovou technologii pro capilární-flow bottom-up proteomiku, nabízejí lepší separaci, citlivost a reprodukovatelnost než tradiční packed-bed kolony. Jejich flexibilita a nízké tlakové nároky umožňují rychlejší a spolehlivější analýzy.

Reference

1. Bruderer R. et al., Mol. Cell. Proteom. 2019, 18, 1242–1254.
2. Bian Y. et al., Nat. Commun. 2020, 11, 157.
3. De Malsche W. et al., Anal. Chem. 2008, 80, 5391–5400.
4. De Malsche W. et al., Anal. Chem. 2012, 84, 1214–1219.
5. Neue U. D., J. Chromatogr. A 2008, 1184, 107–130.