Exploring linear sequence determinants of inferred Collisional Cross-Sections of unmodified and phosphorylated peptides in an Orbitrap Mass Analyzer

Význam tématu

Určení kolizního průřezu srážek (CCS) iontů přidává proteomickým měřením další rozměr selektivity a strukturálních informací. Tradiční přístupy vyžadují iontově-mobilitní buňky. Nová metoda využívá časový útlum signálu ve FT-Orbitrap analyzátoru a umožňuje inferovat CCS přímo, bez dedikované mobilitní sekce, což zjednodušuje instrumentaci a rozšiřuje dostupnost této analytiky v laboratořích s Orbitrap Exploris 480.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje optimalizaci workflow pro vyšetřování CCS unmodifikovaných i fosforylovaných peptidů v komplexních proteomických směsích. Cílem bylo ověřit reprodukovatelnost, porovnat inferované CCS s publikovanými IMS daty a analyzovat vliv sekvenčních determinant, jako jsou prolin, histidin a post-translační modifikace, na konformační kompakci peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek: 100 ng HeLa tryptického digestu separovaného nano-LC 21min gradientem.
• Hmotnostní spektrometr: Orbitrap Exploris 480 s drobnými úpravami UHV komory.
• UHV podmínky: 3,70×10⁻¹⁰ mbar (kontrola) vs. 4,33×10⁻⁹ mbar (test).
• MS1 rozlišení: 60 000, 120 000 a 240 000; MS2 rozlišení: 15 000.
• Data processing: vlastní software postavený na MaxQuant.

Hlavní výsledky a diskuse

• Zvýšení UHV tlaku zlepšuje útlum iontové signálu a umožňuje přesnější inferenci CCS, avšak s mírným poklesem kvality spekter a identifikační výtěžnosti.
• Nejlepší kompromis mezi diskriminací CCS a výtěžností identifikací bylo dosaženo při 120 000 rozlišení MS1.
• Porovnání s IMS daty prokázalo vysokou lineární korelaci (r² ≈ 0,96, Pearsonovo r ≈ 0,9), což potvrzuje validitu Orbitrapové metody.
• Sekvenční determinanty: vysoký obsah prolinu, především v interních pozicích, koreluje s nižšími CCS díky lepší solvataci pozitivních míst; histidin blízko C-konce vyvolává kompaktnější konformace.
• Fosforylace způsobuje redukci CCS oproti nefosforylovaným peptidům; kompresní efekt roste s molekulovou hmotností a počtem nábojů.

Přínosy a praktické využití metody

Orbitrapová inferenční metoda CCS rozšiřuje možnosti strukturové charakterizace proteomických vzorků bez nutnosti iontové mobility. Nabízí vysokou propustnost, srovnatelnou přesnost s IMS a umožňuje studium post-translačních modifikací a sekvenčních determinant v rutinních analýzách.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace CCS inferencí do standardních proteomických pipeline pro detailní analýzu konformačních změn.
• Vývoj strojového učení pro predikci CCS z aminokyselinové sekvence.
• Rozšíření na analýzu větších proteinů, komplexů a kombinované IMS-Orbitrap přístupy.

Závěr

Studie ukazuje, že inferenční určení kolizního průřezu srážek v Orbitrap Exploris 480 je robustní, reprodukovatelné a komplementární k IMS. Metoda umožňuje detailní výzkum strukturálních determinant peptidů v komplexních vzorcích a představuje cenově i časově efektivní alternativu pro rozšíření proteomických analýz o CCS dimenzi.

Reference

1. Yang F., Voelkel J.E., Dearden D.V. Collision Cross Sectional Areas from Analysis of FTICR Line Width: A New Method for Characterizing Molecular Structure. Analytical Chemistry, 84, 4851–4857 (2012).
2. Sanders J.D. et al. Determination of collision cross-sections of protein ions in an Orbitrap mass analyzer. Analytical Chemistry, 90(9), 5896–5902 (2018).
3. Meier F. et al. Deep learning the collisional cross sections of the peptide universe from a million experimental values. Nature Communications, 12(1), 1–12 (2021).
4. Ogata K., Chang C.H., Ishihama Y. Effect of phosphorylation on the collision cross sections of peptide ions in ion mobility spectrometry. Mass Spectrometry, 10(1), A0093–A0093 (2021).