Determination of collision cross sections of proteins using frequency domain linewidths and time domain decay profile fitting of MS1 data from an Orbitrap mass spectrometer

Význam tématu

Analýza kolizních průřezů (collision cross sections, CCS) bílkovin poskytuje cenné informace o jejich konformační struktuře a složení komplexů. Tradičně se CCS určují pomocí hmotnostní spektrometrie s iontovou mobilitou, ale využití Orbitrapu pro měření časových a frekvenčních charakteristik signálu nabízí alternativní přístup bez nutnosti speciálních IM přístrojů.

Cíle a přehled studie

Studie porovnává dvě metody výpočtu CCS přímo z MS1 dat získaných na Orbitrapu:

• fitování časového útlumu signálu (time-domain decay fitting),
• určování šířky pásu (FWHM) z frekvenčního spektra.

Testovány byly transients pro jednotlivé i smíšené nabité stavy bílkovin (cytochrom C, myoglobin, ubiquitin) a výsledky se srovnávaly s literárními CCS měřeními z iontové mobility.

Použitá instrumentace

OrbitrapTM hmotnostní spektrometr (Thermo Fisher Scientific, Bremen) se sběrem full MS1 transientů a izolací jednotlivých nabitých stavů. Data byla zpracována v prostředí Matlab (FFT) a OriginLab (Lorentzovské fitování pásu).

Použitá metodika

1. Sběr časových průběhů iontového signálu (transientů) pro celé spektrum MS1 nebo izolovaný nabitý stav.
2. Převedení transientu do frekvenční domény pomocí rychlé Fourierovy transformace.
3. Výpočet CCS z parametru útlumu (decay constante) metodou fitování časového průběhu.
4. Určení CCS z FWHM Lorentzovského profilu ve frekvenčním spektru.
5. Srovnání vypočtených CCS s referenčními hodnotami z iontové mobility.

Hlavní výsledky a diskuse

• Obě metody (time-domain i FWHM) poskytly CCS shodné s hodnotami z literatury pro cytochrom C, myoglobin i ubiquitin.
• Výpočty provedené na smíšených nabitých stavech vedly ke stejným výsledkům jako u izolovaných stavů, což naznačuje robustnost přístupu.
• Metoda FWHM je schopna eliminovat některá omezení spojená s rozlišením ve fitování časového útlumu, avšak stále mírně zaostává v přesnosti za decay fittingem.

Přínosy a praktické využití metody

Orbitrapové CCS výpočty umožňují doplnit nebo nahradit iontovou mobilitu při studiu struktur bílkovin bez investic do specializovaných IM přístrojů. Metody lze aplikovat pro rychlou QC bílkovin, výzkum konformací či studium agregací.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace algoritmů pro přesnější FWHM fitování i při nižším rozlišení spektra.
• Integrace s automatizovanými datovými toky pro vysokopropustné charakterizace proteinů.
• Rozšíření na komplexní proteiny a multi-komponentní směsi v biologických vzorcích.

Závěr

Orbitrap umožňuje spolehlivé stanovení kolizních průřezů proteinů dvěma vzájemně se doplňujícími metodami. Decay profile fitting i FWHM analýza vykazují dobrou shodu s iontovou mobilitou a poskytují flexibilní nástroje pro strukturální studia bílkovin v MS1 režimu.

Reference

• Sanders J. D. et al. Anal. Chem. 2018, 90 (9), 5896–5902.
• Anupriya; Gustafson E.; Mortensen D. N.; Dearden D. V. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2018, 29 (2), 251–259.
• Bush M. F. et al. Anal. Chem. 2010, 82 (22), 9557–9565.