Advancing nanoLC-MS sensitivity for single cell proteomics using solid silicon micro-pillar array column technology

Význam tématu

Ultra citlivá nanoLC-MS analýza umožňuje identifikovat a kvantifikovat proteiny z extrémně nízkých množství biologického materiálu, což je klíčové pro výzkum jednotlivých buněk a biomarkerů.

Cíle a přehled studie

Prokázat zvýšení pokrytí proteomu a zrychlení analýzy sub-nanogramových vzorků využitím 50 cm µPAC™ Neo mikropilířkové kolony a metodou rozpětí průtoku u standardní LC-MS sestavy.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: Thermo Scientific™ Pierce™ HeLa Protein Digest Standard (0,25–2 ng).
Chromatografie: 50 cm µPAC™ Neo non-porous pilířková kolona (75 µm i.d.), řízené rozpětí průtoků 750→250→125→65 nL/min, lineární gradient organického rozpouštědla.
Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific™ Vanquish™ Neo UHPLC, Orbitrap™ Exploris™ 240, EASY-Spray™ ionizátor; DDA Top10, rozlišení MS1 120 000, MS2 60 000, HCD CE 30; dynamická exkluze 20 s.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované flow rate ramping metody snížily mrtvý objem kolony z desítek na 2 minuty, čímž se zachovala vysoká citlivost a zrychlila analýza.
Při 65 nL/min byla ionizační účinnost vyšší než při 250 nL/min, což vedlo k až 16% navýšení identifikací proteomu.
Z 1 ng vzorku HeLa proteinu bylo pomocí CHIMERYS algoritmu identifikováno stabilně až 2862 proteinových skupin (oproti ~1600 s jinými workflow).
Při 250 pg byl dosažená identifikace ~1500 proteinů, při 500 pg až ~2000 proteinů.
Label free kvantifikace prokázala, že 60–80 % identifikovaných proteinů lze kvantifikovat s CV ≤ 20 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje analýzu sub-nanogramových vzorků s vysokou reprodukovatelností a průchodností až 100 vzorků denně. Je ideální pro single-cell proteomiku, QA/QC v biotechnologii a farmaceutickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování zahrnuje automatizovanou přípravu vzorků, paralelizaci kapalinových cest, pokročilé algoritmy strojového učení pro analýzu spekter a kombinaci s dalšími separačními technikami pro multiplexní proteomiku.

Závěr

Studie dokazuje, že 50 cm µPAC™ Neo kolona s řízeným rozpětím průtoku poskytuje výjimečnou citlivost a rychlost analýzy pro sub-nanogramová množství proteinových vzorků, čímž zásadně rozšiřuje možnosti ultra citlivé proteomiky.