Multi-Attribute Monitoring of Antibody Variants through Hydrophobic and Cation- Exchange Chromatography Coupled with Native Mass Spectrometry

Význam tématu

Multidimenzionální chromatografie spojená s nativní hmotnostní spektrometrií (MS) představuje moderní přístup pro komplexní charakterizaci monoklonálních protilátek. Spojení hydrofobní interakční chromatografie (HIC) s kationtovou výměnnou chromatografií (WCX) odstraňuje potřebu offline frakcionace, snižuje ztráty vzorku a významně zkracuje dobu analýzy. Tento postup je klíčový pro přesné sledování variant protilátek v biotechnologickém vývoji a kontrole kvality.

Cíle a přehled studie

• Vyvinout online 2D-LC workflow kombinující HIC a WCX s MS-kompatibilními těkavými pufry
• Umožnit selektivní přenos frakcí z první dimenze do druhé metodou heart-cut
• Demonstrace schopnosti separace a charakterizace variant protilátky mAb A v nativním stavu

Použitá metodika a instrumentace

• První dimenze: HIC na AdvanceBio HIC kolonce (4,6×100 mm, 3,5 µm) s pufrem amoniového acetátu
• Druhá dimenze: WCX na Agilent Bio WCX NP5 kolonce (4,6×250 mm, 5 µm)
• UHPLC systém: Agilent 1290 Infinity II
• MS detekce: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF se zdrojem Dual AJS-ESI
• Parametry MS: rozsah m/z 2500–20000, drying gas 12 L/min při 350 °C, sheath gas 12 L/min při 300 °C, fragmentor 200 V, sběr 1 spektra/s
• Software: ChemStation C.01.07 pro heart-cut a MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition 10.0

Hlavní výsledky a diskuse

• Native HIC-MS: mAb A se dělí na jeden hlavní pík a tři menší; ionizační obal v m/z 5000–7000, nabíjecí stavy +21 až +29
• Native WCX-MS: identifikováno sedm dobře rozlišených píků – čtyři kyselé (A1–A4), jeden hlavní (M1) a dva bazické (B1–B2)
• 2D-HIC-WCX: čtyři hlavní frakce z HIC byly postupně heart-cut přeneseny do WCX; hlavní frakce vykázala kompletní rozlišení na kyselé, hlavní a bazické varianty; pre- a post-píky vykazovaly nízkou intenzitu a nízké rozlišení
• Orthogonalita HIC a WCX umožňuje rozšířenou charakterizaci variant v jediném běhu

Přínosy a praktické využití metody

• Bez offline frakcionace, minimalizace ztrát vzorku
• Úspora času a prostředků díky online 2D-LC workflow
• Možnost detekce nízkoabundantních variant
• Vysoké rozlišení heterogenity mAb v nativním stavu

Budoucí trendy a možnosti využití

• Aplikace na další biologické léky a virové vektory jako adeno-asociované viry
• Vývoj nových kombinací orthogonálních chromatografií
• Automatizace a pokročilá datová analýza včetně strojového učení
• Integrace do multi-attribute monitoring (MAM) workflow v biotechnologickém průmyslu

Závěr

Online 2D-LC workflow kombinující HIC a WCX s nativní MS nabízí rychlou a robustní platformu pro detailní charakterizaci variant monoklonálních protilátek. Metoda prokázala vysokou citlivost a selektivitu při analýze mAb A a představuje perspektivní nástroj pro biopharmaceutický vývoj a kontrolu kvality.

Reference

1. Camperi J., Goyon A., Guillarme D., Zhang K., Stella C. Multi-dimensional LC-MS: the next generation characterization of antibody-based therapeutics by unified online bottom-up, middle-up and intact approaches. Analyst, 146(3), 747–769 (2021).
2. Chen B., Peng Y., Valeja S.G., Xiu L., Alpert A.J., Ge Y. Online Hydrophobic Interaction Chromatography-Mass Spectrometry for Top-Down Proteomics. Analytical Chemistry, 88(3), 1885–1891 (2016).
3. Wei B., Han G., Tang J., Sandoval W., Zhang Y.T. Native Hydrophobic Interaction Chromatography Hyphenated to Mass Spectrometry for Characterization of Monoclonal Antibody Minor Variants. Analytical Chemistry, 91(24), 15360–15364 (2019).
4. Wu Z., Wang H., Tustian A., Qiu H., Li N. Development of a Two-Dimensional Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Platform for Simultaneous Multi-Attribute Characterization of Adeno-Associated Viruses. Analytical Chemistry, 94(7), 3219–3226 (2022).