Multi-attribute monitoring of aggregates and charge variants of monoclonal antibody through native 2D- SEC-MS-WCX-MS

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) jsou klíčovou třídou bioterapeutik. Kontrola jejich kritických kvalitativních atributů, zejména agregátů a nabíjecích variant, je nezbytná pro zajištění bezpečnosti a účinnosti léčiv. Heterogenita velikosti a náboje může ovlivnit stabilitu, biologickou aktivitu a imunitní odpověď, proto je vyžadována přesná a rychlá analýza těchto forem.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit nový workflow pro simultánní monitorování velikostních a nabíjecích variant mAb A v jejich nativním stavu. Tento přístup kombinuje dvoudimenzionální chromatografii SEC-WCX s přímým napojením na hmotnostní spektrometr, čímž se zkracuje doba analýzy a zvyšuje efektivita detekce.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala:

• D1 – velikostní analýza na AdvanceBio SEC kolóně (300 Å, 2,7 µm) za průtoku 0,3 ml/min.
• Heart-cut modifikace s ASM ventilem (G1170A, faktor 5) pro přenos hlavní monomerní frakce do D2.
• D2 – WCX analýza na Bio MAb NP5 kolóně (2,1 × 250 mm, 5 µm) za průtoku 0,15 ml/min.
• MS detekce – Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s AJS-ESI zdrojem pro nativní hmotnostní spektrometrii.

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow umožnil:

• Simultánní SEC-UV profilování a WCX separaci s přímým MS odběrem.
• Identifikaci dutých monomerních a oligomerních forem za nativních podmínek.
• Deconvoluci hmotností pro stanovení posttranslačních modifikací: až 4x deamidace, glykace nebo oxidace na jednotlivých nabíjecích frakcích.
• Analýzu vlivu tepelného a foto-stresu na agregaci a nabíjecí varianty mAb A, včetně detekce změn v monomerních a dimerických formách.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší:

• Celkovou dobu analýzy 25 minut oproti 90 minutám u samostatných procedur.
• Možnost nativní intaktní hmotnostní analýzy bez manuální manipulace s frakcemi.
• Vyšší automatičnost a nižší nároky na pracovní zásah při hodnocení CQAs.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Rozšíření na další třídy proteinových bioterapeutik a biosimilars.
• Integrace vícedimenzionálních chromatografických technik (3D-LC) pro komplexní MAM (Multi-Attribute Monitoring).
• Automatizace datové analýzy a nasazení v regulované QC laboratoři.
• Detailní zkoumání vlivu stresových podmínek na strukturální varianty pomocí nativního MS.

Závěr

Předložený nativní 2D-SEC-MS-WCX-MS workflow umožňuje rychlou, spolehlivou a kvantitativní analýzu velikostních a nabíjecích variant monoklonálních protilátek v jediném automatizovaném běhu. Metoda kombinuje výhody SEC a WCX s intaktní hmotnostní spektrometrií a významně zkracuje dobu a složitost analýz.

Reference

1. Goyon A., Beck A., Veuthey J. L., Guillarme D., Fekete S. Comprehensive Study on the Effects of Sodium and Potassium Additives in Size Exclusion Chromatographic Separations of Protein Biopharmaceuticals. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 144, 242–251.
2. Trappe A., Füssl F., Carillo S., Zaborowska I., Meleady P., Bones J. Rapid Charge Variant Analysis of Monoclonal Antibodies to Support Lead Candidate Biopharmaceutical Development. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2018, 1095, 166–176.
3. Verscheure L. et al. 3D-LC-MS with 2D Multimethod Option for Fully Automated Assessment of Multiple Attributes of Monoclonal Antibodies Directly from Cell Culture Supernatants. Anal. Chem. 2022, 94, 6502–6511.
4. Sarin D., Kumar S., Rathore A. S. Multiattribute Monitoring of Charge-Based Heterogeneity of Recombinant Monoclonal Antibodies Using 2D HIC-WCX-MS. Anal. Chem. 2022, 94(43), 15018–15026.