Analysis of Sialylated Glycan Modification in Protein Therapeutics

Význam tématu

Glykozylace, obzvláště sialylace N-glykanů, zásadně ovlivňuje farmakokinetiku, účinnost a bezpečnost proteinových léčiv.
Kvantifikace a kontrola sialylovaných struktur jsou klíčové pro zajištění konzistence a kvality bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Článek představuje novou metodologii pro rychlou a reprodukovatelnou analýzu sialylovaných N-glykanů v proteinových terapiích.
Postup kombinuje Agilent AdvanceBio Gly-X N-glycan prep s InstantPC značením a aniontově výměnnou chromatografií (AEX) k přesné kvantifikaci jednotlivých sialylovaných forem.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnuje denaturaci, enzymatickou deglykozylaci, značení InstantPC a purifikaci pomocí cleanup destičky.
Klíčové kroky:

• Deglykozylace v deglycosylation plate: 90 °C po 3 min a 50 °C po 5 min.
• InstantPC značení: 5 µl barviva při 50 °C po 1 min.
• Čištění značkovaných glykanů pomocí destičky.
• Aniontově výměnná chromatografie na Agilent Bio SAX kolonce při pH 8,5 s gradientem NaCl.
• Detekce FLD (λEx 285 nm, λEm 345 nm).

Použitá instrumentace:

• Agilent 1260 Infinity II LC systém s kvaternárním čerpadlem a FLD.
• Bio SAX kolona (4,6 × 250 mm, 5 μm, PEEK).
• Buffer Advisor software.
• AdvanceBio Gly-X N-glycan prep s InstantPC kit (96-ct, GX96-IPC).

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace pH elučního pufru ukázala nejlepší rozlišení izomerů při pH 8,5.
Výpočet Z-hodnoty umožňuje kvantifikovat relativní zastoupení sialylovaných forem (SA0–SA4).
Zdvojnásobení množství InstantPC zvýšilo signál o ~20 % bez vlivu na hodnoty Z.
Recovery značených glykanů po purifikaci přesáhla 95 % pro všechny izomery.
Sériové overlay chromatogramů prokázalo vysokou reprodukovatelnost šesti po sobě jdoucích injekcí.

Přínosy a praktické využití metody

• Kompletní příprava a značení během přibližně jedné hodiny.
• Vysoká citlivost pro fluorescenční i hmotnostní spektrometrii.
• Vhodné pro rutinní QC testy v biotechnologických a farmaceutických laboratořích.
• Přesná separace a kvantifikace sialylovaných N-glykanů usnadňuje kontrolu kritických kvalitativních atributů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace přípravy vzorků a zpracování dat pro vysokopropustnou analýzu.
• Rozšíření metody o paralelní hmotnostní spektrometrii pro detailní strukturální charakterizaci glykanů.
• Aplikace na další glykosylace, jako fukosylace nebo galaktosylace.
• On-line monitoring glykoformací v průběhu bioprodukčních procesů.

Závěr

Popsaný postup kombinuje InstantPC značení s aniontově výměnnou chromatografií a nabízí rychlou, robustní a kvantitativní analýzu sialylovaných N-glykanů.
Metoda je vhodná pro rutinní kontrolu kritických kvalitativních parametrů proteinových terapeutik v QC laboratořích.

Reference

1. Yuen C. T. et al. Glycan Analysis of Glycoprotein Pharmaceuticals: Evaluation of Analytical Approaches to Z Number Determination in Pharmaceutical Erythropoietin Products. Biologicals 2011, 39(6), 396–403.
2. Agilent Technologies. Agilent AdvanceBio Gly-X N-Glycan Prep with InstantPC Kit, 96-ct. User Manual, publication number 5994-1231EN, 2019.
3. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China: Volume III. 2020.
4. Yan J.; Jones A. Streamlined Workflows for N-Glycan Analysis of Biotherapeutics Using Agilent AdvanceBio Gly-X InstantPC and 2-AB Express Sample Preparation with LC/FLD/MS. Agilent Technologies Application Note, publication number 5994-1348EN, 2021.