Development of a Rapid APTS Sample Preparation Workflow for N-Glycan Release and Labeling

Význam tématu

Metoda označování N-glykanů fluorescenčním barvivem APTS představuje klíčový krok ve vývoji bioterapeutik. Umožňuje detailní analýzu glykanového profilu, který ovlivňuje imunogenicitu, farmakokinetiku a farmakodynamiku proteinových léčiv. Rychlá a reprodukovatelná příprava vzorku je proto nezbytná pro efektivní charakterizaci a kontrolu kvality biomedicínských produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a ověřit zkrácený pracovní postup pro uvolnění a značení N-glykanů barvivem APTS v rámci platformy Agilent AdvanceBio Gly-X. Studie porovnává novou expresní metodu (celkový čas ~2,5 h) s tradičními postupy (4–5 h) a demonstruje její použitelnost na příkladech mAb Rituxan (MabThera) a Fc-fúze Enbrel.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorková příprava: AdvanceBio Gly-X APTS Express a Agilent GlykoPrep Rapid N-Glycan Prep s APTS
• Enzymatické uvolnění N-glykanů pomocí PNGase F v in-solution formátu
• Štěpení glykozamin na redukujícím konci a následné značení APTS eliminující potřebu vysušení vzorku
• Čištění: vakuu poháněná filtrace na 96-jamkové destičce, >99 % odstranění volného barviva
• Separace a detekce:
  • Capilární elektroforéza na Agilent Gly-Q (LEDIF, 310/>385 nm)
  • Capilární elektroforéza na Sciex PA800-plus (LIF, 488/520 nm)
  • UHPLC-HILIC na amide kolóně (50 mM ammonium formiát, gradient 30–60 %, teplota 60 °C)

Hlavní výsledky a diskuse

• Nový pracovní postup zkracuje přípravu na 2,5 h oproti 4–5 h klasických metod
• Čištění odstraní více než 99 % volného APTS bez selektivní ztráty jednotlivých glykanů
• Reprodukovatelnost: %CV hlavních glykanových vrcholů <3 % při šesti replikátech
• Kompatibilita výsledků s historickými daty GlykoPrep APTS zajišťuje kontinuitu analýzy
• Metoda zachovává sialylované glykanové druhy, což dokazují srovnání před a po ošetření neuraminidázou
• Možnost separace APTS-glykanů na různých CE systémech a UHPLC-HILIC

Přínosy a praktické využití metody

Rychlý a automatizovatelný workflow zvyšuje produktivitu laboratoří zabývajících se vývojem a kvalitou bioterapeutik. Díky eliminaci kroku vysoušení je minimalizován čas a riziko ztráty vzorku, přičemž výsledky jsou konzistentní a porovnatelné napříč studiemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj v oblasti vysokopropustných platforem pro glykovou analýzu povede k plné integraci s automatizovanými systémy a digitálními nástroji pro zpracování dat. Kombinace CE a UHPLC-HILIC s pokročilou bioinformatikou umožní podrobnější charakterizaci glykanových struktur, včetně forem obsahujících modifikované cukry.

Závěr

AdvanceBio Gly-X APTS Express představuje efektivní a spolehlivý nástroj pro rychlou přípravu a značení N-glykanů, který zkracuje čas analýzy, zachovává kvalitu dat a kompatibilitu s existujícími metodami. Tento postup usnadňuje robustní charakterizaci glykanů v biologickém vývoji a kontrole kvality bioterapeutik.

Reference

1. Planinc A. et al. Glycan Characterization of Biopharmaceuticals: Updates and Perspectives. Anal. Chim. Acta. 2016;921:13–27.
2. Liu L. Antibody Glycosylation and its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Monoclonal Antibodies and Fc-fusion Proteins. J. Pharm. Sci. 2015;104(6):1866–1884.
3. Jones A. N-Glycan Analysis of Biotherapeutic Proteins. BioPharm International. 2017;30(6):20–25.
4. Szekrényes A. et al. Multi-Site N-glycan Mapping Study 1: Capillary Electrophoresis – Laser Induced Fluorescence. MAbs. 2016;8(1):56–64.
5. ProZyme N-glycan standards. Agilent Technologies; dostupné online.
6. Reusch D. et al. High-throughput Glycosylation Analysis of Therapeutic Immunoglobulin G by Capillary Gel Electrophoresis Using a DNA Analyzer. MAbs. 2014;6(1):185–196.