Glycosylation and Sialic Acid Analysis of Biotherapeutic Glycoproteins

Význam tématu

Glykozylace bioterapeutických glykoproteinů je klíčovým parametrem ovlivňujícím farmakokinetické a farmakodynamické vlastnosti, imunogenicitu a stabilitu léčiv. Přesná charakterizace N-glykanů a sialových zbytků je proto nezbytná pro vývoj, optimalizaci a kontrolu kvality moderních bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem předložené práce je popsat komplexní workflow pro analýzu uvolněných N-glykanů a sialových zbytků na modelových bioterapeutikách. Autoři porovnávají dvě hlavní značení glykanů (InstantPC a 2-AB), prezentují chromatografické a hmotnostní detekční strategie a představují metody kvantifikace celkové i druhové sializace.

Použitá metodika a instrumentace

Ukázaný protokol Gly-X zahrnuje:

• Enzymatickou denaturaci a rychlou deglykozylaci PNGase F (5 min).
• Značení glykanů metodou InstantDye (InstantPC nebo InstantAB) nebo klasickým 2-AB express (60 min; bez sušení).
• Čištění označených glykanů a následnou UHPLC-HILIC separaci na AdvanceBio Glycan Mapping column.
• Detekci FLD (ex/em InstantPC 285/345 nm, 2-AB 260/430 nm) a hmotnostní spektrometrii Q-TOF (6545XT AdvanceBio).
• Celkovou kvantifikaci sialové kyseliny pomocí fluorescence v mikrodestičce (SAQ kit) a profiling jednotlivých druhů (Neu5Ac, Neu5Gc) po DMB derivatizaci a RP-UHPLC-FLD.

Použitá instrumentace zahrnuje Agilent AssayMAP Bravo, 1260 Infinity II Bio-Inert, 1290 Infinity II LC, 6545XT AdvanceBio Q-TOF a MassHunter BioConfirm B.10.00.

Hlavní výsledky a diskuse

InstantPC značení nabízí výrazně vyšší intenzity FLD i MS signálu ve srovnání s 2-AB. Workflow umožňuje uvolnění a analýzu glykanů z mAb (Rituximab) i Fc-fúzních proteinů (Etanercept) během 45–120 min při zachování vysoké reprodukovatelnosti (<1 % CV FLD, <4 % CV SAQ). HILIC separace rozlišuje izomery sialových vazeb α(2,3) vs. α(2,6). Sialová kvantifikace prokázala přesnost a mez opakovatelnosti pro různé glykoproteiny. DMB profiling umožňuje rozlišit Neu5Ac od Neu5Gc.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený postup je rychlý, snadno automatizovatelný a kompatibilní s vysokotlakými systémy UHPLC. Poskytuje robustní kvantitativní data pro QA/QC a vývoj bioterapeutik, podporuje porovnání historických dat (2-AB) i zavádění moderních InstantPC standardů a knihoven.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se větší automatizace přípravy vzorků, rozšíření glykoformových knihoven a integrace pokročilých datových nástrojů včetně AI pro komplexní interpretaci glykoproteinových profilů. On-line monitoring glykozylace a multimodální detekční přístupy mohou dále zrychlit vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik.

Závěr

Popsaný Gly-X workflow společně se strategiemi pro značení glykanů a sialovou analýzu představuje efektivní, citlivý a reprodukovatelný přístup k charakterizaci glykoproteinů. Metoda podporuje kritické fáze vývoje a QA/QC bioterapeutik a nabízí flexibilitu pro různé instrumentální platformy.

Reference

• Khoury et al., Nat. Sci. Rep. 1 (90), 2011.
• Planinc et al., Anal. Chim. Acta 921, 13–27, 2016.
• Walsh, Nat. Biotechnol. 32(10), 992–1000, 2014.
• Liu, J. Pharm. Sci. 104(6), 1866–1884, 2015.
• Jones, BioPharm Intl. 30, 20–25, 2017.
• Higel et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 100, 94–102, 2016.
• Ghaderi et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 28, 147–175, 2012.