Streamlined Workflows for N-Glycan Analysis of Biotherapeutics Using Agilent AdvanceBio Gly-X InstantPC and 2-AB Express Sample Preparation with LC/FLD/MS

Význam tématu

Glykozylace bioterapeutik zásadně ovlivňuje jejich farmakokinetiku, biologickou aktivitu i imunogenicitu. Analýza N-glykanů proto představuje klíčový kvalitativní atribut (CQA) v procesu vývoje a výroby biologických léčiv. Spolehlivé, rychlé a reprodukovatelné workflow usnadňuje optimalizaci glykoform a podporuje standardizaci kvalitativního řízení bioterapeutik.

Cíle a přehled studie

Cílem předkládané Application Note je představit dva rychlé a zjednodušené postupy pro přípravu a analýzu uvolněných N-glykanů z bioterapeutických glykoproteinů pomocí fluorescenčního značení InstantPC (glykozylaminové značení) a 2-aminobenzamidu (2-AB) s následnou separací HILIC LC/FLD/MS. Studie porovnává výkonnost obou metod na modelech rituximabu (Rituxan) a etanerceptu (Enbrel).

Použitá metodika a instrumentace

Pro uvolnění N-glykanů byl použit enzym PNGase F a soupravy Agilent AdvanceBio Gly-X InstantPC (příprava ~1 h) a Gly-X 2-AB Express (příprava ~2 h). Značení probíhá buď jednorázově glykozylaminovou reakcí InstantPC, nebo reduktivní aminací s 2-AB bez nutnosti sušení vzorku. Očištění volných barviv se provádí HILIC SPE. Separace značených glykanů se uskutečňuje na kolonce Agilent AdvanceBio Glycan Mapping (2,1 × 150 mm, 1,8 µm) s gradientem acetonitril/ammonium formiátu (pH 4,5), teplota kolony 40 °C, průtok 0,5 mL/min. FLD detekce: InstantPC (Ex 285 nm, Em 345 nm), 2-AB (Ex 260 nm, Em 430 nm). MS analýza byla prováděna na Agilent 6545XT Q-TOF ve vysokém rozlišení (4 GHz), režim pozitivní ESI.
Instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II UHPLC (pumpa, autosampler, kolona termostat, FLD detector)
• Agilent AdvanceBio Glycan Mapping kolona
• Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF
• Software: MassHunter Acquisition a BioConfirm s PCD databází

Hlavní výsledky a diskuse

HILIC separace obou způsobů značení poskytla dobře rozlišené píky hlavních N-glykanů (G0F, G1F[6]/[3], G2F, sialylované izoformy). Relativní plocha píků v replikách (n=4) vykázala nízkou variační míru (%RSD pod 3 % pro majoritní formy). Značení InstantPC přineslo vyšší intenzitu fluorescenčního signálu a výrazně lepší ionizační účinnost v MS (srovnání píků Man5 na FLD i TIC) oproti dlouhodobě používanému 2-AB.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby přípravy (InstantPC ~1 h, 2-AB ~2 h) oproti tradičním postupům.
• Vysoká reprodukovatelnost a throughput vhodný pro rutinní kontrolu glykozylace v QA/QC laboratořích.
• InstantPC zvýšený fluorescenční signál a lepší citlivost MS usnadňují detekci nízkopodílových glykanů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zrychlování a automatizace glykoanalytických workflow (robotizace, online deglykozylace).
• Vývoj nových fluorescenčních a hmotnostně značících reagentů pro zvýšení citlivosti a specifity.
• Integrace HILIC separace s MS/MS a softwarovým mapováním glycoform pro podrobnou strukturální analýzu.
• Rozšíření metody na komplexní glykomiku a multiplexní analýzu bioterapeutik.

Závěr

Prezentované workflow Agilent Gly-X InstantPC a 2-AB Express představuje rychlé, reprodukovatelné a vysoce citlivé postupy pro analýzu N-glykanů bioterapeutik. InstantPC nabízí vyšší detekční citlivost ve FLD i MS, zatímco 2-AB zajišťuje kontinuitu s historickými daty. Oba přístupy podporují efektivní monitoring glykozylace v průmyslové i akademické praxi.

Reference

• 1. Liu L. Antibody Glycosylation and its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Monoclonal Antibodies and Fc-Fusion Proteins. J. Pharm. Sci. 2015, 104(6), 1866–1884.
• 2. Anumula K. R. Advances in Fluorescence Derivatization Methods for High-Performance Liquid Chromatographic Analysis of Glycoprotein Carbohydrates. Anal. Biochem. 2006, 350, 1–23.
• 3. Kimzey M. et al. Development of a 5-Minute Deglycosylation Method for High Throughput N-Glycan Analysis by Mass Spectrometry. ProZyme Technical Note, Bulletin 4001, Rev E.
• 4. Yan J. et al. Preparation of Released N-Glycan Samples from Monoclonal Antibodies Using Agilent AdvanceBio Gly-X 2-AB Express for LC-Fluorescence Analysis. Agilent Technologies Application Note, 5994-0682EN, 2019.
• 5. Houel S. et al. N- and O-Glycosylation Analysis of Etanercept Using Liquid Chromatography and Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry Equipped with Electron-Transfer Dissociation Functionality. Anal. Chem. 2014, 86, 576–584.