Analysis of Adeno-Associated Virus Quality Attributes with LC-FLD-(MS)

Význam tématu

Adeno-asociované virové vektory představují klíčový nástroj v oblasti genové terapie díky schopnosti efektivně dopravovat genetický materiál do cílových buněk. Jejich komplexní struktura a nízké titry vyžadují přesné a citlivé analytické metody pro zajištění kvality produkovaných vektorů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit chromatografické workflow zajišťující stanovení tří kritických kvalitativních atributů AAV: agregace, poměru plných a prázdných kapsid a identifikace a relativní množství kapsidových proteinů.

Použitá metodika a instrumentace

• Agilent 1260 Infinity II Fluorescence Detector (Ex 280 nm, Em 340 nm)
• Size-exclusion chromatography na Bio SEC-5 kolóně (4.6×300 mm, 5 μm, 1000 Å), mobilní fáze 50 mM fosfát + 400 mM NaCl, pH 7.4
• Anion exchange chromatography na Bio SAX NP5 PK kolóně (2.1×50 mm, 5 μm), gradient tetramethylammonium chloridu
• Reverse phase LC na Zorbax RRHD StableBond C3, Diphenyl a C18 kolónách (2.1×100 mm, 1.8 μm), 75–80 °C, eluenty IPA, ACN, voda, FA, TFA
• High-resolution MS na Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF

Hlavní výsledky a diskuse

• Analýza agregátů ukázala nízké množství (<1.3 %) u nestražených vzorků AAV-2 a AAV-9, zatímco po stresu se agregace zvýšila na ~7.5 % a fragmentace na 8.8 %.
• Metoda pro stanovení poměru plných/prázdných kapsid prokázala lineární rozsah 5–90 % plných kapsid s RSD ≤11.2 % a dolní mez kvantifikace ≤5 % plných kapsid při RSD ≤15 %.
• RP-LC umožnila separaci kapsidových proteinů VP1–VP3 na C18 a Diphenyl kolónách v závislosti na serotypu a stanovení jejich poměru blízkého očekávané stoichiometrii 1:1:10.
• Intaktní hmotnostní spektrometrie identifikovala neočekávanou substituci Ala→Tyr v VP1, která byla potvrzena následnou MS/MS analýzou tryptických peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Robustní kontrola kvality AAV vektorů v produkčním procesu genové terapie
• Rychlá a přesná kvantifikace klíčových atributů pro rozhodování ve výrobě
• Detekce a potvrzení mutací či modifikací kapsidových proteinů

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace automatizovaných a vysokopropustných systémů, zavedení nových detektorů s vyšší citlivostí a aplikace cílených metod pro detailní charakterizaci virových vektorů, včetně posttranslačních modifikací.

Závěr

Prezentované LC-FLD-(MS) workflow poskytuje komplexní a reprodukovatelnou analýzu klíčových atributů AAV vektorů. Umožňuje rychlou detekci agregace, spolehlivé stanovení poměru plných/prázdných kapsid a detailní charakterizaci kapsidových proteinů, čímž významně přispívá ke kvalitativní kontrole genových terapeutických přípravků.

Reference

1. Backovic A et al. Capsid Protein Expression and Adeno-Associated Virus like Particles Assembly in Saccharomyces Cerevisiae. Microb Cell Fact 2012, 11, 124.
2. Trilisky E I, Lenhoff A M. Flow-Dependent Entrapment of Large Bioparticles in Porous Process Media. Biotechnol Bioeng 2009, 104, 127–133.