Optimizing Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Protein Analysis Using UPLC and UPLC-MS

Význam tématu

Rekombinantní adeno-asociované viry (rAAV) představují klíčové vektory v genové terapii díky nízké toxicitě a dlouhodobé expresi. Struktura a složení jejich kapsidu zásadně ovlivňují účinnost transdukce, bezpečnost i kvalitu výsledných produktů. Spolehlivá a citlivá metoda pro identifikaci, kvantifikaci a charakterizaci kapsidových proteinů (VP1, VP2, VP3) je zásadní pro vývoj a kontrolu kvality genových terapií.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo implementovat a optimalizovat LC-optickou a LC-MS metodu na platformě Waters BioAccord pro analýzu intaktních AAV kapsidových proteinů. Metoda byla nejprve validována na serotypu AAV8 (identifikace, stanovení stechiometrie, detekce post-translačních modifikací), poté rozšířena na další běžné serotypy (AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV9) k prokázání obecné použitelnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Platforma: Waters BioAccord integrující ACQUITY UPLC I-Class PLUS a ACQUITY RDa MS detektor pod správou waters_connect/UNIFI v1.9.9.
Chemikálie: LC-MS-grade voda, acetonitril, IonHance™ DFA (0,1 %), octová kyselina (10 %).
Vzorky: rAAV serotypy 1, 2, 5, 6, 8, 9, ředěné na 1×10¹³ GC/mL, denaturovány 10 % acetic acid, centrifugovány.
Kolony: ACQUITY UPLC Protein BEH C4 (300 Å, 2.1×100 mm, 1.7 µm), BEH C8 (130 Å) a BEH C18 (300 Å) pro AAV5 adaptaci.
Podmínky LC: gradient 68–64 % A (H2O + 0.1 % DFA) vs. B (ACN + 0.1 % DFA) během 16 min, tok 0,2 mL/min, teplota kolony 80 °C.
Detekce FLR: λexc 280 nm, λem 350 nm; MS: ESI+ 400–7000 m/z, desolvace 550 °C, capillary 1,5 kV, lock mass Leu-enkephalin.

Hlavní výsledky a diskuse

- Přechod od formiové k difluoro octové kyselině (DFA) významně zlepšil chromatografické rozlišení VP1, VP2 a VP3 na C8 i C4 kolónách.
- Na C4 (300 Å) bylo dosaženo nejostřejších a nejlépe separovaných špiček pro AAV8, umožňující intaktní měření hmotností: VP1 ~81 668 Da, VP2 ~66 518 Da, VP3 ~59 805 Da a VP3 fragment (~50 592 Da).
- Identifikovány byly post-translační modifikace (acetylace, fosforylace), odstranění N-terminálního methioninu i hydrolýza Asp–Pro v VP3.
- Optická detekce (UV vs. FLR) umožnila kvantitativní stanovení stechiometrie. FLR zvýšila citlivost ~50× (detekce 50 ng proteinu), reprodukovatelně stanovila poměr VP1:VP2:VP3.
- Aplikace na další serotypy potvrdila širokou použitelnost. U AAV5 bylo nutné použít C18 kolonu pro optimální návrat VP1 kvůli jeho zvýšené hydrofobicitě.

Přínosy a praktické využití metody

• Robustní, rychlé a citlivé rozlišení a hmotnostní analýza jednotlivých kapsidových proteinů.
• Spolehlivé stanovení poměru VP1:VP2:VP3 zásadní pro kontrolu kvality a potence vektorů.
• Detekce a identifikace PTM s vysokou přesností, podporující bezpečnostní a regulační požadavky.
• Snadná implementace ve výzkumných i GMP prostředích díky platformě BioAccord.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace plně automatizovaných workflow pro vysokoprůchodové testování rAAV včetně glykanové analýzy.
• Rozšíření metodiky na nové serotypy a inženýrované varianty s odlišnými hydrofobními vlastnostmi.
• Využití pokročilé datové analýzy v waters_connect/UNIFI pro komplexní profilování proteinových variací.
• Implementace v reálném čase ve výrobních linkách pro rychlou kontrolu kvality genových terapií.

Závěr

Optimalizované LC-FLR a LC-MS metody na BioAccord platformě poskytují vysoké rozlišení, citlivost a spolehlivost pro intaktní analýzu i kvantifikaci AAV kapsidových proteinů. Metoda podporuje komplexní charakterizaci a kontrolu kvality genových terapeutik napříč různými serotypy.

Reference

• Finer M., Glorioso J. A brief account of viral vectors and their promise for gene therapy. Gene Ther. 2017;24:1–2.
• Lisowski L., Tay S.S., Alexander I.E. Adeno-associated virus serotypes for gene therapeutics. Curr Opin Pharmacol. 2015;24:59–67.
• Van Vliet K., Mohiuddin Y., McClung S. et al. Adeno-associated virus capsid serotype identification: analytical methods development and application. J Virol Methods. 2009;159:167–177.
• Girod A., Wobus C.E., Zadori Z. et al. The VP1 capsid protein of adeno-associated virus type 2 is carrying a phospholipase A2 domain required for virus infectivity. J Gen Virol. 2002;83:973–978.
• Popa-Wagner R., Porwal M., Kann M. et al. Impact of VP1-specific protein sequence motifs on adeno-associated virus type 2 intracellular trafficking and nuclear entry. J Virol. 2012;86:9163–9174.
• Jin X., Liu L., Nass S., O'Riordan C., Pastor E., Zhang K. Direct liquid chromatography/mass spectrometry analysis for complete characterization of recombinant adeno-associated virus capsid proteins. Hum Gene Ther Methods. 2017;28:255–267.
• Shion H. et al. Enabling routine and reproducible intact mass analysis when data integrity matters. Waters Application Note. 2019.
• Ranbaduge N. et al. Routine peptide mapping analysis using the BioAccord System. Waters Application Note. 2019.
• Zhang X. et al. Released N-linked glycan analysis using the BioAccord System. Waters Application Note. 2019.
• Kellett J. et al. Application of difluoroacetic acid to improve optical and MS performance in peptide LC-UV/MS. Waters Application Note. 2019.
• Vlasak J., Ionescu R. Fragmentation of monoclonal antibodies. mAbs. 2011;3(3):253–263.
• Snijder J., van de Waterbeemd M., Damoc E. et al. Defining the stoichiometry and cargo load of viral and bacterial nanoparticles by Orbitrap mass spectrometry. J Am Chem Soc. 2014;136:7295–7299.
• Bosma B., Plessis F., Ehlert E. et al. Optimization of viral protein ratios for production of rAAV serotype 5 in the baculovirus system. Gene Ther. 2018;25:415–424.