Characterization of Adeno-Associated Viral assemblies on an Ultra-High Mass Range Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer

Význam tématu

Adeno-asociované virové částice (AAV) představují špičkovou platformu pro cílenou dodávku genetických materiálů v genterapii. Detailní charakterizace strukturálních vlastností kapsidových proteinů, jejich proteoform a stoichiometrií v rámci virové částice je nezbytná pro vývoj bezpečných a účinných terapeutik. Mass spectrometrie s vysokou přesností měření umožňuje spolehlivou detekci hmotnostních variant, posttranslačních modifikací i kvantifikaci prázdných a naplněných kapsid.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo ověření schopností hybridního kvadrupól–Orbitrap spektrometru Q Exactive UHMR pro analýzu intaktních AAV částic za téměř nativních podmínek a pro LC–MS top-down rozbor jednotlivých proteinových podjednotek. Studie zahrnovala:

• intaktní mass analysis virových částic AAV2 a AAV6 za nativních podmínek
• iontově-výměnnou chromatografii (IEX) s fluorescenční detekcí pro stanovení prázdné vs. naplněné kapsidy
• reverzně-fázi top-down LC–MS/MS pro identifikaci proteoform VP1, VP2, VP3 a jejich posttranslačních modifikací

Použitá metodika a instrumentace

Pro intaktní měření byly vzorky bufferovány do 100 mM acetátu amonného a vnášeny static nanospray zdrojem. Proteinové podjednotky se analyzovaly po kyselé denaturaci a RP UHPLC separaci. Relativní kvantifikace prázdných vs. plných částic proběhla pomocí IEX UHPLC sefluorescenčním detektorem. Všechny MS a MS/MS experimenty byly provedeny na Thermo Scientific Q Exactive UHMR hybridním kvadrupól–Orbitrap spektrometru.

Hlavní výsledky a diskuse

Intaktní nativní MS potvrdila přítomnost prázdných a naložených kapsid v poměru přibližně 64 % : 36 %. U AAV2 byla rozlišena trojice hlavních stoichiometrií VP1:VP2:VP3 (5:5:50, 5:6:49, 5:7:48) se zřetelně baseline‐rozdělenými nabitými stavy. Top-down fragmentace metodou All Ion Fragmentation (AIF) za vysoké energie prokázala lokalizaci N-terminálních acetylací a fosforylací (Ser-11, Thr-56) v podjednotce VP2 s přesností lepší než 10 ppm. Mass accuracy pro VP subjednotky dosáhla hodnoty pod 4 ppm.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje komplexní pohled na virové částice od intaktní hmotnosti po detailní mapování modifikací proteinových podjednotek. Díky vysokému rozlišení a přesnosti lze spolehlivě kvantifikovat prázdné a naplněné kapsidy, určit proteoformy a lokalizovat PTM. To podporuje optimalizaci výroby AAV v rámci QA/QC a vývoj nových genterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

S dalším rozvojem bude možné zvyšovat propustnost metod, integrovat automatizované platformy pro terapii na bázi virových vektorů a rozšířit aplikace na další genové vektory (lentiviry, adenoviry). Kombinace s ion mobility spektrometrií či AI‐řízenou analýzou dat slibuje hlubší porozumění struktury a dynamiky proteoform v komplexních biologických vzorcích.

Závěr

Hybridní kvadrupól–Orbitrap Q Exactive UHMR prokázal vynikající schopnosti pro charakterizaci AAV částic za nativních i denaturačních podmínek. Celek metodiky umožňuje přesné stanovení intaktních hmotností, kvantifikaci prázdných vs. naplněných kapsid, detailní top-down analýzu proteoform a lokalizaci klíčových posttranslačních modifikací. Tato celistvá přístupová platforma posiluje výzkum a výrobu virových vektorů pro genterapii.