LC/MS of Intact Adeno-Associated Virus Capsid Proteins for Rapid Confirmation of Product Identity

Význam tématu

Adeno-asociované viry (AAV) představují perspektivní vektor pro genovou terapii vzácných a genetických onemocnění. Klíčovou složkou kvality a bezpečnosti AAV léčiv jsou tři kapsidové proteiny VP1, VP2 a VP3, které musí být jednoznačně identifikovány před uvolněním produktu. Tradiční antibody-based metody často narážejí na vysokou homologii mezi serotypy a požadavky na specifické protilátky, zatímco LC/MS nabízí přímé měření hmotnosti proteinů a vysokou selektivitu bez nutnosti generovat pro každý typ AAV speciální protilátky.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této aplikace bylo vyvinout a optimalizovat rychlou a robustní LC/FLD-MS metodu pro separaci a potvrzení identity intaktních kapsidových proteinů z různých serotypů AAV (2, 7, 9, 7m8, DJ, rh10, Anc80). Metoda zahrnovala minimalizovanou přípravu vzorku odolnou vůči vysoké koncentraci solí i detergentům, chromatografickou optimalizaci na třech typech ZORBAX RRHD fází a následnou hmotnostní analýzu s dekonvolucí signálu a peptidovým mapováním k potvrzení případných mutací.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: Denaturace v 3 M guanidinu HCl a 40 mM DTT ve 200 mM amonném hydrogen uhličitanu (pH 8) při 70 °C po dobu 15 min; bez nutnosti výměny pufru.
• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity II LC systém (High Speed Pump G7120A, Multisampler G7167B, Multicolumn Thermostat G7116B) se ZORBAX RRHD SB-C18 a SB-Diphenyl 300 Å kolony (2,1 × 100 mm, 1,8 μm); mobilní fáze A 0,1 % TFA+0,1 % FA ve vodě, B 90 % IPA+9,8 % voda+0,1 %TFA+0,1 %FA; gradient 0–26 min, teplota 80 °C, průtok 0,4 mL/min.
• Detekce: Agilent 1260 Infinity Fluorescence Detector (280 nm excitace, 360 nm emise).
• Hmotová spektrometrie: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Jet Stream zdrojem, teplota 350 °C, rozsah 900–3200 m/z, dekonvoluce v MassHunter BioConfirm 10.0 (55–85 kDa, maximální entropie).
• Peptidové mapování: Redukce a alkylace, trypsinové štěpení ve dvou krocích, čištění AssayMap Bravo, separace na AdvanceBio Peptide Mapping koloni (2,1 × 150 mm, 2,7 μm), MS/MS DDA Top10.

Hlavní výsledky a diskuse

• SB-C18 kolona byla jediná, která poskytla baseline separaci VP1, VP2 a VP3. SB-C3 a SB-Diphenyl nesplnily požadavky na rozlišení VP1 a VP3.
• Dekonvoluované hmotnosti pro všechny proteiny odpovídaly teoretickým hodnotám s přesností ≤32 ppm.
• U serotypu AAV-2 byl u VP1 pozorován přírůstek +29,6 Da, což vedlo k hypotéze bodové substituce; potvrzeno MS/MS peptidovým mapováním a Sanger sekvenováním plazmidu (GCC→ACC, Ala→Thr).
• Testování na dalších šesti serotypech ukázalo univerzálnost metody. Pro AAV-9, rh10 a Anc80 byla nutná varianta na SB-Diphenyl pro optimální rozlišení.
• Relativní kvantifikace FLD potvrdila očekávanou stechiometrii VP1:VP2:VP3 ~1:1:10 s mírnými odchylkami obsahu VP1 v různých sériích.
• Deamidace VP1 u serotypů DJ a rh10 byly pravděpodobně způsobeny kultivačními podmínkami nebo oteplením při přípravě vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá kontrola identity AAV kapsidových proteinů bez nutnosti specifických protilátek.
• Vhodné pro QA/QC testování uvolňovací fáze léčiv i pro vývoj mutantních knihoven.
• Možnost relativní kvantifikace stechiometrie proteinů, klíčové pro funkčnost vektorů.
• Jednoduchá a odolná příprava vzorku kompatibilní s vysokou solností a detergenty.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace do vysoce průtokových screeningových platforem a real-time PAT monitoring.
• Rozšíření aplikace na další serotypy a inženýrské variace AAV, včetně detailního mapování PTM.
• Automatizace datové analýzy a pokročilá kvantifikace založená na signálech MS.
• Kombinace s dalšími technikami (IM-MS, HDX, top-down MS) pro hlubší charakterizaci strukturálních variant.

Závěr

Navržená LC/FLD-MS metoda s Agilent 1290 Infinity II a 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF ve spojení se ZORBAX SB-C18 a SB-Diphenyl stacionárními fázemi poskytuje robustní, přesnou a rychlou analýzu intaktních AAV kapsidových proteinů. Metoda umožňuje spolehlivou identifikaci i detekci bodových mutací a relativní kvantifikaci stechiometrie napříč různými serotypy, což z ní činí klíčový nástroj pro vývoj a kontrolu kvality genových terapií.

Reference

1. Keeler A. M., Flotte T. R. Recombinant Adeno-Associated Virus Gene Therapy in Light of Luxturna a dalších, Annu. Rev. Virol. 2019, 6, 601–621.
2. Backovic A. a kol. Capsid Protein Expression and AAV-like Particle Assembly v Saccharomyces Cerevisiae, Microb. Cell Fact. 2012, 11, 124.
3. US FDA. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy INDs, Guidance for Industry 2020.
4. Kuck D., Kern A., Kleinschmidt J. A. Development of AAV Serotype-Specific ELISAs Using Novel Monoclonal Antibodies, J. Virol. Methods 2007, 140, 17–24.
5. Jin X. a kol. Direct LC/MS Analysis for Complete Characterization of Recombinant AAV Capsid Proteins, Hum. Gene Ther. Methods 2017, 28, 255–267.
6. Bosma B. a kol. Optimization of Viral Protein Ratios for RAAV Serotype 5 Production v Baculovirus systému, Gene Ther. 2018, 25(6), 415–424.
7. Rehder D. S. a kol. RPLC/MS of Reduced Monoclonal Antibodies, J. Chromatogr. A 2006, 1102, 164–175.
8. Matuszewski B. K., Constanzer M. L., Chavez-Eng C. M. Strategie pro hodnocení Matrix Effect v kvantitativních HPLC-MS/MS metodách, Anal. Chem. 2003, 75(13), 3019–3030.
9. Long W. J., Mack A. E. Comparison of Selectivity Differences Among Agilent ZORBAX Phenyl Columns Using Acetonitrile či Methanol, Agilent 5990-4711EN 2009.
10. Popa-Wagner R. a kol. Impact of VP1-Specific Sequence Motifs on AAV2 Intracellular Trafficking and Nuclear Entry, J. Virol. 2012, 86, 9163–9174.
11. Zhang Y. a kol. Identification of AAV Capsid Proteins Using ZipChip CE/MS, Anal. Biochem. 2018, 555, 22–25.