Comprehensive workflow for targeted cell metabolomics using automated sample preparation, HILIC chromatography, LC/TQ, and a statistical analysis software suite

Význam tématu

Buněčná metabolomika umožňuje detailní sledování změn malomolekulárního složení v biologických vzorcích, což je klíčové pro pochopení biochemických drah, diagnostiku onemocnění a vývoj léčiv. Kombinace automatické přípravy vzorků, robustní chromatografie a citlivé LC/TQ detekce zvyšuje reprodukovatelnost a průchodnost analytických protokolů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované práce je vyvinout komplexní a přenosný workflow pro cílenou buněčnou metabolomiku, který zahrnuje:

• Automatizovanou extrakci polárních metabolitů na platformě Bravo.
• HILIC chromatografii na sloupci Poroshell 120 HILIC-Z v systému 1290 Infinity II Bio LC.
• Detekci na trojitém kvadrupólu 6495C LC/TQ s iontovým trychtýřem.
• Statistickou analýzu dat v softwaru Mass Profiler Professional.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow obsahuje tyto hlavní kroky a přístroje:

• Lyze a okamžité zchlazení (quenching) 1×10⁶ buněk K562.
• Polarizovaná extrakce na Bravo platformě se SPE kartami a následné vysušení a rekonstituci v 80 % acetonitrilu.
• HILIC chromatografie s Poroshell 120 HILIC-Z sloupcem, 0,5 mL/min, obousměrná ionizace (pozitivní i negativní mód).
• Detekce 274 metabolitů v dynamickém MRM režimu na 6495C LC/TQ, databáze vytvářená v MassHunter Optimizer (>500 látek).
• Integrace dat v MassHunter Quant a následná statistická analýza v Mass Profiler Professional (ANOVA, fold-change).

Hlavní výsledky a diskuse

• Retenční časy byly reprodukovatelné s RSD <5 % během 11 dní.
• Při krátkých dobách sběru (<1 ms) bylo detekováno přes 250 metabolitů v buněčné matrici, celkem 274 cílených látek.
• Citlivost metody dosahuje fmol úrovní na kolonu (13C-fenylalanin lineární od 0,5 do 10 000 ng/mL).
• PCA analýza a heatmapy prokázaly jasné rozlišení skupin podle přidané koncentrace, RSD nežádaných signálů pod 20 %.
• Mass Profiler Professional identifikoval přibližně 60 významně diferencovaných metabolitů s možností další normalizace.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizace zvyšuje reprodukovatelnost a minimalizuje pipetovací chyby.
• Přenosnost chromatografických podmínek mezi laboratořemi zajišťuje konzistentní výsledky.
• Široká databáze metabolitů umožňuje flexibilní rozšíření sledovaných drah.
• Workflow je vhodný pro velkoobjemové studie a rychlý přechod od dat k biologickým závěrům.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s vysokorozlišovacími analyzátory pro neoznačené profily.
• Rozšíření databáze o lipidy a posttranslační modifikace proteinů.
• Implementace real-time QC a pokročilých normalizačních algoritmů.
• Využití umělé inteligence pro automatizovanou interpretaci dat.
• Přizpůsobení workflow pro single-cell metabolomiku.

Závěr

Představený workflow kombinuje automatizovanou extrakci, robustní HILIC chromatografii, citlivou detekci na LC/TQ a rozsáhlou databázi metabolitů s pokročilou statistickou analýzou. Metoda nabízí vysokou průchodnost, reprodukovatelnost a komplexní pokrytí klíčových metabolických drah, což usnadňuje rychlý přechod od experimentálních dat k biologickým závěrům.

Reference

• Van de Bittner GC a kol. A Comprehensive Workflow for Routine, Automated, Metabolite + Lipid Analysis of Mammalian Cells. Metabolomics Conference Poster, 2020, #74.
• Yannell KE a kol. Improvements to HILIC Robustness – a Targeted HILIC Metabolomics Method for Routine Analysis. ASMS, 2021.