An End-to-End Targeted Metabolomics Workflow

Význam tématu

Metabolomika poskytuje klíčové informace o stavu buněčného metabolismu prostřednictvím analýzy drobných molekul (metabolitů). Cílená metabolomika umožňuje přesné a kvantitativní stanovení specifických skupin metabolitů zapojených do biologických dějů, což je zásadní pro pochopení buněčné fyziologie, biomarkerů a farmakodynamiky.

Cíle a přehled studie

Tato aplikace popisuje end-to-end workflow pro cílenou metabolomiku platných jak pro plazmu, tak pro kultivované buňky. Hlavním cílem je představit plně automatizovanou přípravu vzorků, spolehlivou chromatografickou separaci a citlivou detekci pro rutinní kvantifikaci stovek metabolitů v biologických matricích.

Použitá metodika a instrumentace

• Automatizace přípravy vzorků: Agilent Bravo Metabolomics Sample Prep platforma zajišťuje homogenizovaný a reprodukovatelný odběr 20 µl plazmy nebo izolovaného buněčného lyzátu.
• Odstranění lipidů: Captiva EMR–Lipid SPE destičky kombinují velikostní vyloučení a hydrofobní interakce pro redukci iontového potlačení.
• Chromatografická separace: UHPLC Agilent 1290 Infinity II Bio LC se sloupcem InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z (2,1 × 150 mm, 2,7 µm) v režimu HILIC pH 9,3 na bázi 20 mM amonium acetátu a acetonitrilu.
• Detekce: Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/MS s Agilent JetStream ion source a dMRM metodou optimalizovanou v MassHunter Optimizer pro více než 500 metabolitů při době akvizice 1 ms.
• Software: MassHunter Acquisition 10, Quantitative Analysis 10 pro integraci, Mass Profiler Professional pro statistickou analýzu (PCA, heat mapy a další vizualizace).

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow umožnil detekci 266 metabolitů v plazmě a 274 v buněčných vzorcích. Robustní HILIC separace prokázala reprodukovatelné časové okna (<0,1 min) napříč šaržemi a laboratořemi. Citlivost LC/TQ umožnila kvantifikaci aminokyseliny fenylalaninu již od 1,2 amol a ADP od 20 amol s RSD ≤10 %. Statistická analýza PCA a heat map potvrdila spolehlivé rozlišení vzorkových skupin podle cílených spike-in úrovní.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda zkracuje dobu přípravy díky automatizaci, minimalizuje lidské chyby a zajišťuje vysokou reprodukovatelnost. Díky dMRM databázi a modulárnímu nastavení lze workflow přizpůsobit různým výzkumným záměrům od biomarkerového screeningu po farmakologické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrovaná řešení bude možné rozšířit o stable-isotope dilution kvantifikaci či další chromatografické režimy pro zvýšení pokrytí metabolomu. Očekává se také hlubší integrace s pokročilou bioinformatikou, strojovým učením a rozsáhlými datovými platformami pro prediktivní medicínu.

Závěr

Popsaný end-to-end workflow spojuje automatizovanou přípravu vzorků, robustní HILIC separaci a citlivou Triple-Quadrupole detekci, čímž poskytuje spolehlivou a snadno použitel­nou platformu pro cílenou metabolomiku ve výzkumných i průmyslových laboratořích.

Reference

1. Zamboni N.; Saghatelian A.; Patti G. J. Defining the Metabolome: Size, Flux, and Regulation. Mol. Cell. 2015, 58(4), 699–706.
2. Roberts L. D.; Souza A. L.; Gerszten R. E.; Clish C. B. Targeted Metabolomics. Curr. Protoc. Mol. Biol. 2012, 30.
3. Van de Bittner G.; Sartain M.; Chang D.; Apffel A.; Bernick K.; Gomez M. An Automated Dual Metabolite + Lipid Sample Preparation Workflow for Mammalian Cell Samples. Agilent Technologies, 2022.
4. Spivia W. R.; Raedschelders K.; Gomez M.; Van Eyk J. E. Automated Metabolite Extraction for Plasma Using the Agilent Bravo Platform. Agilent Technologies, 2019.
5. Sartain M.; Gomez M.; Van de Bittner G.; Shu H. Enabling Automated, Low-Volume Plasma Metabolite Extraction with the Agilent Bravo Platform. Agilent Technologies, 2022.
6. Stone P.; Glauner T.; Kuhlmann F.; Schlabach T.; Miller K. New Dynamic MRM Mode Improves Data Quality and Triple quad Quantification in Complex Analyses. Agilent Technologies, 2009.
7. Banu Mohsin S.; Batoon P. Absolute Quantitation of Fragile Metabolites by Isotope Dilution Mass Spectrometry on the Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/MS. Agilent Technologies, 2022.
8. Yannell K. E.; Cuthbertson D.; Simmermaker C.; Van de Bittner G.; Parry E. Improvements to HILIC Robustness – a Targeted HILIC Metabolomics Method for Routine Analysis. Agilent Technologies, 2021.