Machine learning statistics with chromatography and high-resolution mass spectrometry aid in combatting illegal logging and trafficking of endangered timber species

Význam tématu

Metabolomické analýzy hrají klíčovou roli při zkoumání biochemických procesů v biologických vzorcích. Cílem je dosáhnout vysoké analytické citlivosti a širokého pokrytí polárních metabolitů bez kompromisů v reprodukovatelnosti. Robustní, přenosný a automatizovatelný workflow umožňuje rychlé získání kvalitních dat pro biomedicínský výzkum, farmakokinetiku i environmentální studie.

Cíle a přehled studie / článku

Studie navrhla a ověřila komplexní workflow pro cílenou metabolomiku, které kombinuje automatizovanou přípravu vzorku, HILIC chromatografii a vysoce citlivou kvadrupólovou detekci ve dvojitém režimu ionizace. Hlavními cíli bylo:

• Vyvinout protokol pro extrakci malomolekulárních metabolitů z malého objemu plazmy.
• Zajistit reprodukovatelnost retencí a citlivost měření napříč laboratořemi.
• Sestavit rozsáhlou databázi >400 metabolitů s optimalizovanými přechody v dynamickém MRM režimu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byla využita automatizovaná stanice Bravo Metabolomics Workbench s Captiva EMR-Lipid SPE destičkou k selektivnímu odstraňování proteinů a lipidů.
Chromatografie:

• Kolona Poroshell 120 HILIC-Z (2,1×150 mm, 2,7 µm) s povrchovou úpravou pro stabilní retence polárních látek.
• Pohyblivá fáze A: 20 mM acetát amonný, pH 9,3 + 5 µM medronová kyselina; fáze B: acetonitril.
• Nelineární gradientový profil 0,5–16 min, doba analýzy 24 min včetně re-ekvilibrace.

Detekce:

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC ve spojení s 6495C LC/TQ.
• Dynamický MRM režim se spínáním ionizace pozitivní/negativní, doba sběru signálu 5 ms pro přechod.
• Databáze obsahující 2 selektivní přechody pro každý metabolit.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou reprodukovatelnost retencí (RSD < 5 %) napříč různými kolony, laboratořemi a operátory. HILIC chromatografie bez iontově párovacích činidel umožnila současné měření v obou ionizačních režimech a oddělila izobarické či strukturální isomery (např. leucin/izoleucin). V bovinní plazmě bylo detekováno a kvantifikováno přes 200 metabolitů s LOQ v řádu femtomolů (např. 20 fmol 15N5-ADP, 1,2 fmol 13C-fenylalaninu) a důkazy o lineární detekční křivce s R² > 0,98.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow umožňuje rychlou implementaci cílené metabolomiky ve výzkumných i rutinních aplikacích:

• Automatizovaná příprava vzorku šetří čas a minimalizuje variabilitu.
• Široké metabolomické pokrytí klíčových drah (aminokyseliny, TCA cyklus, glykolýza, nukleotidy).
• Možnost absolutní kvantifikace pomocí izotopově značených interních standardů.
• Přenositelnost metody mezi laboratořemi zajišťuje konzistentní data.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj očekává:

• Rozšíření databáze přechodů o další biochemické dráhy a modifikované metabolity.
• Integraci strojového učení pro zrychlenou identifikaci a kvantifikaci.
• Adaptaci na jiné biologické a environmentální matrice, včetně tkání či vodních vzorků.
• Propojení s nestrukturovanou (untargeted) metabolomikou pro komplexnější profilování.

Závěr

Navržené workflow spojuje robustní HILIC chromatografii, citlivou kvadrupólovou detekci a automatizovanou přípravu vzorků, což umožňuje spolehlivou a přenosnou cílenou metabolomickou analýzu komplexních biologických vzorků. Metoda je vhodná pro široké spektrum aplikací od základního výzkumu až po rutinní laboratorní provoz.

Reference

1 Sartain M, Gomez M, Van de Bittner G, Shu H. Enabling Automated, Low-Volume Plasma Metabolite Extraction with the Agilent Bravo Platform. Agilent Application Note 5994-2156EN.