Improvements to HILIC Robustness - a Targeted HILIC Metabolomics Method for Routine Analysis

Význam tématu

Metabolomika je klíčová pro pochopení biologických procesů a identifikaci biomarkerů. Robustní a reprodukovatelná metoda HILIC-TQ umožňuje analýzu polarních metabolitů ve složitých matricích, jako je plasma, bez potřeby iontových párů, což zvyšuje citlivost a pokrytí metabolomu.

Cíle a přehled studie

Úkolem studie bylo vyvinout a otestovat rutinní, přenosnou cílenou HILIC metodu pro metabolomiku s důrazem na robustnost, analytickou citlivost a reprodukovatelnost mezi laboratořemi. Pro extrakci bylo využito automatizované řešení Bravo Metabolomics Workbench.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC s povlakem MP35N
• Agilent Poroshell 120 HILIC-Z, 2,7 µm, 2,1 × 150 mm
• Agilent 6495C Triple Quadrupole (LC/TQ) s ion funnel
• Bravo Metabolomics Workbench a Captiva EMR-Lipid SPE desky

Metodika

Vzorek: 20 µL bazálního bovinního plazmatického poolu extrahovaného pomocí SPE se sušením dusíkem a rekonstitucí v 85 % acetonitrilu.

Chromatografie: Kolonka HILIC-Z kondicionovaná standardizovaným fosforylačním postupem, eluce s 20 mM acetátovým pufrem (pH 9,3) + 5 µM medronové kyseliny (fáze A) a acetonitril (fáze B), nelineární gradient 0,5–16 min, celkem 24 min včetně reekvilibrace.

Detekce: Dynamický MRM režim na 6495C s přepínáním polárity, typický dwell time 5 ms, databáze > 400 metabolitů s dvěma tranzicemi na analyty.

Hlavní výsledky a diskuse

• Retenční časy (RT) u různých sloučenin a lotů kolonek se ve více laboratořích držely v rámci ± 5 % RSD.
• HILIC metoda umožnila rozlišení isobarických látek (např. leucin/izoleucin) bez iontových párů.
• V plazmě bylo detekováno > 200 endogenních metabolitů v jednom běhu.
• Limity kvantifikace v matrix dosahují fmol úrovně: 20 fmol 15N5-ADP (RSD 10 %), 1,2 fmol 13C-Phe (RSD 1 %), lineární kalibrační křivky R2 > 0,98.
• Metoda byla úspěšně přenesena i do laboratoře bez předchozích zkušeností s HILIC, potvrzená reprodukovatelností RT a kvalitativními parametry.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje robustní platformu pro rutinní cílenou metabolomiku v biomedicínském i průmyslovém výzkumu. Díky automatizované přípravě vzorků a přenosné databázi lze rychle přejít od dat k biologickým závěrům s vysokou reprodukovatelností.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření databáze o další metabolity a izotopické standardy.
• Adaptace na jiné biologické matrice (tkáně, buňky, močenka).
• Integrovaná data z dalších omikových přístupů pro holistickou analýzu.
• Automatizace analýzy a cloudové platformy pro správu dat.

Závěr

Vyvinutá HILIC-TQ workflow spojuje citlivou a reprodukovatelnou chromatografii, automatizovanou přípravu vzorků a rozsáhlou dMRM databázi, čímž umožňuje rutinní cílenou metabolomiku s vysokou přenositelností mezi laboratořemi.

Reference

1. Sartain M., Gomez M., Van de Bittner G., Shu H. Enabling Automated, Low-Volume Plasma Metabolite Extraction with the Agilent Bravo Platform. Agilent Application Note 5994-2156EN.