A Comprehensive Untargeted Metabolomics LC/Q-TOF Workflow with an Unknowns Identification Strategy to Identify Plasma Metabolite Shifts in a Mouse Model

Význam tématu

Vědecké i průmyslové laboratoře stále častěji používají netargetované metabolomické analýzy k odhalení biochemických změn souvisejících s onemocněními, farmakologickými zásahy či environmentálními faktory. Robustní workflow s vysokým výtěžkem a reprodukovatelnou chromatografií umožňuje spolehlivě detekovat a kvantifikovat polaritu metabolitů spolu s možností identifikace dosud neznámých sloučenin.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl vytvořit komplexní workflow od přípravy malomnožných objemů myší plazmy až po statistickou analýzu a neznámé identifikace. Metodu aplikovali na plazmové vzorky šestnáctitýdenních obézních a kontrolních myší (C57BL/6J), aby odhalili dysregulované metabolity a předvedli univerzálnost přístupu.

Použitá metodika a instrumentace

Sample prep:

• Bravo Metabolomics Platform se sorbentem Captiva EMR-Lipid SPE pro vysoce výtěžné extrakce z 20 μL plazmy.
• Post-spike izotopově značených standardů pro kontrolu přesnosti.

Chromatografie a MS:

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC s HILIC-Z kolonou, RSD retenčních časů <5 % během 11 dní.
• Agilent 6546 LC/Q-TOF, All Ions akvizice při 6 Hz, tři kolizní energie.
• Agilent Jet Stream ESI: 225 °C, 9 L/min suspenzní plyn, 375 °C plyn ochranný.
• Q-TOF tune: Fragile (m/z 1700), fragmentor 100 V, skimmer 45 V.

Data processing:

• MassHunter Profinder pro rekurzivní extrakci prvků.
• Mass Profiler Professional (MPP) pro statistické zpracování a IDBrowser s vlastním HILIC PCDL (542 analytů).
• SIRIUS + CANOPUS pro strukturovou predikci a klasifikaci nových neznámých.

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekováno 2 146 znaků (negativní ionizační mód), po filtrování p = 0,05, fold change > 5 a abundanci > 5 000 zůstalo 47 významných rysů.
• PCA a hierarchická klastrovací analýza potvrdily jasné oddělení obézních a kontrolních skupin.
• IDBrowser identifikoval 30 z 47 rysů pomocí vlastního HILIC PCDL (skóre ≥ 70).
• SIRIUS strukturová analýza přidala 5 nových identifikací (skóre ≥ 82) a CANOPUS klasifikoval metabolitické třídy.
• Systém vykázal průměrnou hmotnostní chybu < 0,5 ppm a delta RT < 0,02 min (n = 50).

Přínosy a praktické využití metody

Methoda nabízí automatizovanou, vysoce reprodukovatelnou platformu pro netargetované metabolomické studie s možností identifikace známých i nových sloučenin. Díky přenositelným chromatografickým podmínkám a osvědčené SPE přípravě umožňuje porovnání dat mezi různými laboratořemi a přístroji.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření PCDL a veřejných spektrálních knihoven pro zrychlení identifikací.
• Integrace strojového učení a AI pro predikci struktur a biologických funkcí.
• Implementace do klinických studií a multi-omics přístupů.
• Vylepšení automatizace a miniaturizace pro vysokopropustné formáty.

Závěr

Vyvinutý workflow kombinuje robustní extrakci, přenositelnou HILIC-Z chromatografii a vysokorozlišovací LC/Q-TOF analýzu s pokročilou softwarovou podporou. Studie prokázala aplikovatelnost metody na model obezity a identifikovala klíčové metabolické posuny, čímž poskytla cenný nástroj pro metabolomické objevy.

Reference

1. Sartain M. et al. Enabling Automated, Low-Volume Plasma Metabolite Extraction with the Agilent Bravo Platform. Agilent Technologies Application Note, 2020.
2. Yannell K.E. et al. Improvements to HILIC Robustness – a Targeted HILIC Metabolomics Method for Routine Analysis. ASMS 2021.
3. Dührkop K. et al. SIRIUS4: a rapid tool for turning tandem mass spectra into metabolite structure information. Nature Methods 16, 2019.
4. Dührkop K. et al. Systematic classification of unknown metabolites using high-resolution fragmentation mass spectra. Nature Biotechnology, 2020.