Characterization of the Anticoagulant Nadroparin by 2D-LC With High‑Resolution MS

Význam tématu

Low molecular weight heparins (LMWH) představují komplexní heterogenní biomolekuly široce používané jako antikoagulancia. Charakterizace jejich struktury je klíčová pro zajištění kvality a bezpečnosti léčiv, zejména v případě možné kontaminace nebezpečnými sulfátovanými kongenery. Dvourozměrná kapalinová chromatografie v kombinaci s vysokým rozlišením hmotnostní spektrometrie (2D-LC/HRMS) umožňuje detailní analýzu jednotlivých oligosacharidových frakcí a jejich modifikací.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo demonstrovat workflow pro top-down analýzu LMWH nadroparinu pomocí Agilent 1290 Infinity II Bio 2D-LC a Agilent 6546 LC/Q-TOF. Studie řešila:

• Řešení jednotlivých stupňů polymerizace (DP) pomocí velikostní exkluzní chromatografie (SEC) ve 1. dimenzi.
• Separation oligosacharidových kompozic se stejným DP pomocí ion-pair reverzní fáze (IP-RP) ve 2. dimenzi.
• Detekci izotopových vzorců a přiřazení aduktů v high-resolution MS spektru.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow sestávalo z následujících kroků:

• 1. dimenze: dvojitě sériové zapojení sloupců Agilent AdvanceBio SEC (4.6×300 mm, 1.9 µm) při průtoku 0,2 mL/min, aby se jednotlivé DP rozlišily s RSD retencí 0,04–0,09 %.
• Časované vysokorozlišení střihy (4×3 s) každého DP byla přesměrována do 40 µL smyček pro 2. dimenzi.
• 2. dimenze: Agilent ZORBAX Extend-C18 (2.1×150 mm, 3.5 µm) s gradientem 8–40 % organické fáze obsahující 0,15 % HFIP a 0,2 % PTA v závislosti na DP.
• Detekce MS: Agilent 6546 LC/Q-TOF v negativním režimu, m/z 500–2 500, rozlišení umožnilo zachycení monoisotopických iontů i složených aduktů s PTA a ACN.
• Software: Agilent MassHunter Acquisition 11.0 pro kontrolu 2D-LC a MassHunter Qualitative Analysis 10.0 pro zpracování a rozdělení dat podle střihů.

Hlavní výsledky a diskuse

Ve vzorku nadroparinu bylo identifikováno 28 unikátních oligosacharidových složení od DP6 do DP16. Každý DP vykazoval více komponent lišících se počtem sulfo skupin a aduktů s PTA. Klíčové poznatky:

• SEC dokázala konzistentně rozlišit DPs s vynikající opakovatelností.
• IP-RP ve 2. dimenzi odhalila oddělení izobarických složení se stejným DP.
• High-resolution MS spektra ukázala izotopové vzorce i četné adukty s PTA (7–12 molekul) a ACN, přičemž vyšší obsah sulfo skupin koreloval s vyšším počtem PTA aduktů.

Přínosy a praktické využití metody

Dvourozměrný přístup nabízí:

• Detailní top-down analýzu intactních LMWH bez enzymatické digesce.
• Automatizované vyplachování soli mezi dimenzemi, čímž se eliminuje kontaminace MS ionizátoru.
• Spolehlivou charakterizaci výrobních šarží a detekci nečekaných kontaminantů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje:

• Integrace umělé inteligence a pokročilých algoritmů pro automatizovanou interpretaci 2D-LC/MS dat.
• Rozšíření 2D-LC/HRMS pro analýzu dalších komplexních glykomolekul a biosimilárních produktů.
• Optimalizace ion-pairových režimů a modulárních střihů pro vyšší kapacitu a rychlost analýzy.

Závěr

2D-LC/HRMS kombinace Agilent 1290 Infinity II Bio 2D-LC a 6546 LC/Q-TOF představuje robustní top-down metodu pro detailní charakterizaci LMWH. Workflow s časovanými střihy a IP-RP chromatografií umožňuje odhalit a kvantifikovat četné oligosacharidové složení a přispívá k zajištění kvality antikoagulačních léčiv.

Reference

1. Gray E., Mulloy B., Barrowcliffe T. W. Heparin and Low-Molecular-Weight Heparin. Thromb. Haemost. 2008;99(5):807–818.
2. Mousa S. A. Are Low Molecular Weight Heparins the Same? Methods In Molecular Medicine. 2004;93:Anticoagulants, Antiplatelets, and Thrombolytics.
3. Liu H., Zhang Z., Linhardt R. J. Lessons Learned from the Contamination of Heparin. Nat. Prod. Rep. 2009;26(3):313–321.
4. Wang Z., Chi L. Recent Advances in Mass Spectrometry Analysis of Low Molecular Weight Heparins. Chin. Chem. Lett. 2018;29:11–18.
5. Ouyang Y. et al. Profiling Analysis of Low Molecular Weight Heparins by Multiple Heart-Cutting Two-Dimensional Chromatography with Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2015;87:8957–8963.
6. Agilent Technologies. 2D-LC as an Automated Desalting Tool for MSD Analysis: Direct Mass Selective Detection of a Pharmaceutical Peptide from an MS-Incompatible USP Method. Application Note 5991-8437EN;2017.
7. Doneanu C. E., Chen W., Gebler J. C. Analysis of Oligosaccharides Derived from Heparin by Ion-Pair Reversed-Phase Chromatography/Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2009;81(9):3485–3499.