Optimizing HILIC-based Analyses of RapiFluor-MS Labeled Sialylated N-Glycans

Význam tématu

Terminální sialové kyseliny na N-glykanech významně ovlivňují farmakokinetiku, bioaktivitu i imunogenicitu bioterapeutik a současně jsou citlivými indikátory buněčných procesů v kultivaci. Přesná analýza jejich množství, izomerie vazeb a distribuce se uplatňuje při vývoji a kontrole kvality terapeutických glykoproteinů, stejně tak v biomedicínském výzkumu.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a optimalizovat metodiku kombinující HILIC-FLR-MS pro RapiFluor-MS značené sialylované N-glykany. Hlavní kroky zahrnovaly: ladění parametrů ESI-MS zdroje za účelem maximalizace signálů protonovaných iontů, vylepšení chromatografického rozlišení s použitím širokopórové amidosilné fáze a optimalizaci mobilních fází vysoké iontové síly. Metoda byla doplněna exoglykozidázovými štěpeními pro základní diferenciaci vazeb α2–3 vs. α2–6 sialových zbytků.

Použitá metodika a instrumentace

V analytickém postupu byly využity:

• GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit pro rychlé uvolnění a značení N-glykanů, včetně sialylovaných z výchozího testovacího standardu (fetuin).
• ACQUITY UPLC H-Class Bio System s kolónou Glycoprotein BEH Amide 300 Å (2.1 × 150 mm, 1.7 µm) pro finální HILIC separaci; pro optimalizaci zdroje použit sloupec BEH Amide 130 Å (2.1 × 50 mm).
• Xevo G2-XS QTof Mass Spectrometer, systémové ovládání a zpracování dat prostřednictvím MassLynx 4.1 a UNIFI 1.8, LockSpray Exact Mass Ionization Source pro kontinuální kalibraci.
• Exoglykozidázy New England BioLabs: α2–3 Neuraminidase S a α2–3,6,8,9 Neuraminidase A pro selektivní štěpení sialových vazeb.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizace ESI-MS parametrů vedla k nejvyšší intenzitě signálu protonovaného iontu [A3G3S3+3H]3+ při sampling cone 75 V, desolvační teplotě 500 °C, kapilárním napětí 2200 V, teplotě zdroje 120 °C a průtoku desolvačního plynu 600 L/h.
• Zvyšování koncentrace amonium formiátu v mobilní fázi z 50 na 200 mM signifikantně zlepšilo retenci a rozlišení izomerů silně sialylovaných glykanů, přesto se mírně zvýšila úroveň pozadí signálů. Omezení MS akvizičního rozsahu na 715–2000 m/z efektivně potlačilo nežádoucí šum.
• Neuraminidázové digesce poskytly rychlý přehled o vazbách sialových kyselin: po štěpení α2–3 Neuraminidase S zůstaly přítomny druhové sialylace α2–6, následné kompletní odstranění α2–3,6,8,9 Neuraminidase A potvrdilo relativní zastoupení vazeb v testovaném standardu.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda kombinuje vysokou citlivost FLR a vysoké rozlišení QTof MS s vynikající chromatografickou separací sialylovaných glykanů.
• Umožňuje rutinní QC sledování sialylace a vazebné izomerie bioterapeutik a biologických vzorků.
• Testovací standard poskytuje kontrolu výkonu celého postupu, od uvolnění glykosidů až po MS detekci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s rozsáhlými glykanovými databázemi a číselníky retenčních časů pro automatizovanou identifikaci.
• Rozšíření o technologie iontové mobility pro detailní separaci strukturálních izomerů.
• Automatizace a vysokopropustná analytika glykomiky v rámci vývoje nových bioterapeutik.
• Využití strojového učení a umělé inteligence pro predikci struktury a vazeb sialových kyselin.

Závěr

Popsaná HILIC-FLR-MS metodika s RapiFluor-MS značením, optimalizovanými zdrojovými parametry a mobilními fázemi vysoké iontové síly nabízí robustní platformu pro komplexní profilování sialylovaných N-glykanů. Využití neuraminidáz doplňuje pohled na vazebné izomerie, čímž metoda umožňuje rychlou a spolehlivou charakterizaci kriticky důležitých glykánových atributů.

Reference

1. Varki A. Sialic acids in human health and disease. Trends Mol Med. 2008;14(8):351–360.
2. Ashwell G, Harford J. Carbohydrate-specific receptors of the liver. Annu Rev Biochem. 1982;51:531–563.
3. Weigel PH, Yik JH. Glycans as endocytosis signals: the cases of the asialoglycoprotein and hyaluronan/chondroitin sulfate receptors. Biochim Biophys Acta. 2002;1572(2):341–363.
4. Yuen CT, et al. Relationships between the N-glycan structures and biological activities of recombinant human erythropoietins. Br J Haematol. 2003;121(3):511–526.
5. Joosten CE, Shuler ML. Effect of culture conditions on the degree of sialylation of a recombinant glycoprotein expressed in insect cells. Biotechnol Prog. 2003;19(3):739–749.
6. Martin MJ, Muotri A, Gage F, Varki A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 2005;11(2):228–232.
7. Bardor M, Nguyen DH, Diaz S, Varki A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 2005;280(6):4228–4237.
8. Zhu A, Hurst R. Anti-N-glycolylneuraminic acid antibodies identified in healthy human serum. Xenotransplantation. 2002;9(6):376–381.
9. Nguyen DH, Tangvoranuntakul P, Varki A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid. J Immunol. 2005;175(1):228–236.
10. Fournier J. A Review of Glycan Analysis Requirements. BioPharm Int. 2015;28(10):32–37.
11. Lauber MA, et al. Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagent that Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI-MS Detection. Anal Chem. 2015;87(10):5401–5409.
12. Harvey DJ, et al. Proposal for a standard system for drawing structural diagrams of N‐and O‐linked carbohydrates. Proteomics. 2009;9(15):3796–3801.
13. Glycobase 3.2. http://glycobase.nibrt.ie (accessed Jan 6, 2015).
14. Lauber MA, Koza SM. Enhancing the Peak Capacity of High Molecular Weight N-Glycan HILIC Separations with a Wide-Pore Amide Bonded Stationary Phase. Waters Tech Brief. 2015.
15. Lauber MA, Koza SM, Chambers EE. Comprehensive Characterization of the N and O-Linked Glycosylation of a Recombinant Human EPO. Waters App Note. 2015.
16. Ahn J, Bones J, Yu YQ, Rudd PM, Gilar M. Separation of 2-aminobenzamide labeled glycans using hydrophilic interaction chromatography columns packed with 1.7 µm sorbent. J Chromatogr B. 2010;878(3):403–408.
17. Stencel-Baerenwald JE, Reiss K, Reiter DM, Stehle T, Dermody TS. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nat Rev Microbiol. 2014;12(11):739–749.
18. Lin N, et al. Chinese hamster ovary host cell engineering to increase sialylation of recombinant therapeutic proteins. Biotechnol Prog. 2015;31(2):334–346.
19. Cointe D, Leroy Y, Chirat F. Determination of the sialylation level and of the ratio α-(2→3)/α-(2→6) sialyl linkages of N-glycans by methylation and GC/MS analysis. Carbohydr Res. 1998;311(1):51–59.
20. Guttman M, Lee KK. Site-specific mapping of sialic acid linkage isomers by ion mobility spectrometry. Anal Chem. 2016;88(10):5212–5217.
21. Green ED, Adelt G, Baenziger J, Wilson S, Van Halbeek H. The asparagine-linked oligosaccharides on bovine fetuin. J Biol Chem. 1988;263(34):18253–18268.