Robust extraction, separation, and quantitation of structural isomer steroids from human plasma by SPE-UHPLC-MS/MS

Význam tématu

Analýza steroidních hormonů v lidské plazmě hraje klíčovou roli v klinickém výzkumu a diagnostice endokrinních poruch. Přesné stanovení koncentrací jednotlivých sloučenin je nezbytné pro správnou interpretaci biologických procesů a pro hodnocení terapeutických intervencí. Strukturální isomery steroidů mají totožnou hmotnost a často podobné fragmentační vzorce, což vyžaduje účinnou chromatografickou separaci před detekcí hmotnostní spektrometrií (MS/MS).

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout robustní analytickou metodu pro extrakci, separaci a kvantifikaci dvanácti steroidních hormonů v humánní plazmě. Hlavní body byly:

• Optimalizovat solid phase extraction (SPE) plazmy pro odstranění interferencí.
• Dosáhnout efektivní separace strukturálních isomerů pomocí biphenylové fáze.
• Porovnat selektivitu a rozlišení s běžnou C18 fází.
• Ověřit analytické parametry: linearitu, přesnost, přesnost stanovení (precision), stabilitu retence a rozsah stanovení.

Použitá metodika a instrumentace

Extrahovaná plazma se připravovala zmícháním se zásaditou roztokem síranu zinečnatého, odstředěním a nanesením na SOLAµ HRP SPE destičku. Eluce se prováděla směsí acetonitrilu a metanolu, extrakt se ředil a injektoval na LC-MS/MS systém.

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Horizon s aktivním předehřevem a Accucore Biphenyl 100×2,1 mm, 2,6 µm.
• MS/MS: Thermo Scientific TSQ Quantiva s HESI-II zdrojem v pozitivním ionizačním režimu.
• Mobilní fáze: voda a acetonitril (Metoda 1) nebo voda/methanol s 0,2 mM ammonium fluoridem (Metoda 2).
• Softwarové zpracování: Chromeleon 7.2.8.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda 1 dosáhla separace 11 běžných steroidů v čase 4,2 minuty s vysokou účinností. Metoda 2 umožnila plné rozlišení dvanácti isobarických párů během 12 minut. Biphenylová fáze vykázala oproti C18 výrazně vyšší rozlišení klíčových isomerických párů:

• 21-deoxycortisol vs. 11-deoxycortisol (Rs z 1,9 na 7,9).
• 17α-hydroxyprogesteron vs. 11-deoxycorticosteron (Rs z 3,3 na 4,97).
• Cortisone vs. aldosterone (Rs z 3,89 na 3,35).

Průměrná šířka piku se snížila z 0,066 min (C18) na 0,058 min (biphenyl), což zvýšilo kapacitu metodického gradientu z 146 na 165.

Stabilita retencí při 25 injekcích včetně extraktů PBS a plazmy ukázala RSD < 0,1 %, což je zásadní pro vysoce přesné kvantifikace.

Kalibrační křivky (50–50 000 pg/mL) vykázaly koeficienty determinace > 0,99 a intra- i inter-denní přesnost pod 6 % a přesnost stanovení v rozmezí 95–117 %.

Standard addition testy v plazmě potvrdily robustnost metody s přesností ~ 84–106 % pro jednotlivé hormony.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá metoda umožňuje:

• Spolehlivě rozlišit a kvantifikovat strukturální isomery steroidů v komplexním biologickém matrixu.
• Dosáhnout vysoké citlivosti a širokého dynamického rozsahu až 1000×.
• Zkrátit dobu analýzy a zvýšit laboratorní průtoknost díky rychlé chromatografii.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k:

• Integraci s vysoce resolučními hmotnostními analyzátory pro identifikaci dosud neznámých metabolit.
• Automatizaci přípravy vzorků pro vyšší throughput a minimalizaci lidských chyb.
• Rozšíření panelu o další steroidní a lipofilní molekuly relevantní pro endokrinologii, farmakokinetiku a dopingový výzkum.

Závěr

Použití Accucore Biphenyl kolony ve spojení s UHPLC-MS/MS nabízí významné zlepšení selektivity, rozlišení a stability analýzy steroidních hormonů v lidské plazmě. Metoda poskytuje přesná a precizní data napříč širokým koncentracím, čímž podporuje klinický výzkum a rutinní diagnostiku.

Reference

Thermo Fisher Scientific. Technical Note 21882, 2018.