Extending Capabilities of Real-Time Database Search on the Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer for Multiplexed Proteomics

Význam tématu

Real-Time Search (RTS) na Orbitrap Eclipse umožňuje online vyhledávání peptidových spekter během akvizice, čímž výrazně zvyšuje efektivitu měření multiplexní kvantitativní proteomiky a zachovává vysokou přesnost kvantifikace.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem je zhodnotit nové funkce RTS-MS3 workflow pro TMT kvantifikaci: zavedení algoritmu Close-Out k omezení nadbytečných MS3 skenů a online odhad FDR pro cílenou aktivaci MS3 na základě reálných PSM-level FDR odhadů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky a příprava

• TMT 11plex kvasnicová standardní digest (500 ng, 250 ng/µl, 50 cm EASY-Spray, 50 min gradient)
• TMTpro 16 plex lidské a E. coli peptidy ve směsných poměrech 0:1:2:4:8, 1 µg na injekci, 120 min gradient

Akvizice dat

• Orbitrap Eclipse Tribrid mass spectrometer (ICSW 3.4)
• Thermo Scientific Easy-nLC 1000 a Ultimate 3000 RSLC nano systémy

Analýza dat

• Online hodnocení MS2 spekter pomocí Comet v reálném čase
• Post-acquisition zpracování v Proteome Discoverer 2.5 s enginem Sequest HT

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow RTS-MS3 ve srovnání se standardním SPS-MS3 zvýšil počet kvantifikovaných proteinů o 17 %, přičemž s funkcí Close-Out dosáhl až 26 % nárůstu. Filtr FDR přinesl navíc vyšší počet kvantifikovaných peptidů a spektr. Při zvýšení prahu signál/šum pro reporter ionty byla zachována vysoká přesnost (CV < 20 %). Režim RTS pro výběr TMT fragmentů pro SPS izolaci optimalizuje poměr interference versus signál.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zrychlení a efektivita multiplexního proteomického workflow
• Snížení počtu zbytečných MS3 skenů, úspora instrumentálního času
• Vysoká přesnost, reproducibilita a hloubka kvantifikace

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj směřuje k adaptivním algoritmům řízení akvizice založeným na strojovém učení, dynamickému odhadu FDR v reálném čase, rozšíření na další izotopové značení a vylepšení uživatelského rozhraní pro online optimalizaci parametrů měření.

Závěr

Rozšířený RTS-MS3 na Orbitrap Eclipse významně zlepšuje efektivitu a kvalitu multiplexní TMT kvantifikace. Funkce Close-Out a FDR filtering optimalizují počet skenů a rozšiřují objem kvalitativních dat.