Quantitative Measurement of Plasma Free Metanephrines by Ion-Pairing Solid Phase Extraction and LC-MS/MS with Porous Graphitic Carbon Column

Význam tématu

Plazmatické volné metanefriny (metanefrin, normetanefrin) jsou klíčové biomarkery v diagnostice a výzkumu feochromocytomů a paragangliomů. Jejich nízké koncentrace a vysoká polarita kladou nároky na citlivé a specifické analytické metody. LC-MS/MS představuje zlatý standard díky kombinaci vysoké selektivity a možnosti kvantifikace v nízkých koncentracích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout robustní a vysoce citlivou metodu pro kvantitativní stanovení volných metanefrinů v plasmatických vzorcích. Metoda využívá iontové párování v SPE pro selektivní extrakci a chromatografii na porézním grafitickém uhlíku (PGC) pro optimální rozlišení polárních látek.

Použitá metodika

Sample preparation probíhala na C-18 cartridgích předem kondicionovaných acetonitrilem a 0,1 % perfluorheptanovou kyselinou (PFHA). Po naložení vzorku následovalo vyplachování vodným roztokem PFHA a eluční fáze 60 % acetonitrilu. Suchý zbytek byl rekonstituován pro LC-MS/MS.

Chromatografie byla realizována na Hypercarb PGC kolóně (50×2,1 mm, 5 μm) při 70 °C. Mobilní fáze tvořila 1 % kyseliny mravenčí včetně amonného formiátu a 0,1 % kyseliny mravenčí v acetonitrilu. Gradientní běh trval 7 minut.

Validace zahrnovala testy interferencí (oddělení EPI od NMN), SPE recovery, iontové potlačení, stanovení dolní hranice kvantifikace (LLOQ), linearity, přesnosti, přesnosti opakování a carry-over.

Použitá instrumentace

• Termo Scientific TSQ Vantage triple stage kvadrupólový hmotnostní spektrometr
• Termo Scientific Accela UHPLC systém
• Hypercarb PGC kolóna (50×2,1 mm, 5 μm)
• HESI-II ionizační zdroj v pozitivním režimu

Hlavní výsledky a diskuse

Interference: Epinefrin-d3 byl plně rozlišen od NMN-d3 na PGC kolóně. SPE recovery: Absolutní výtěžnost 86,4–97,5 %, relativní recovery metanefrinu 97,7 % a normetanefrinu 113,5 %.

Iontové potlačení: Post-column infusion neprokázal signifikantní potlačení signálu při analýze lidské plasmy. LLOQ: 7,2 pg/mL pro metanefrin a 18,0 pg/mL pro normetanefrin. Linearita R² >0,99 v rozsahu 7,2–486,8 pg/mL (MN) a 18,0–989,1 pg/mL (NMN).

Přesnost: Intra-a inter-assay CV 2,1–10,9 % v CSS a 6,3–7,8 % v lidské plasmě. Carry-over nebyl pozorován až do 500–1000 ng/mL.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysokou citlivost a specifitu pro klinické a farmakokinetické studie volných metanefrinů. Rychlá příprava vzorku, krátký chromatografický běh a nízké riziko interferencí umožňují nasazení v routine analýze.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace automatizovaných SPE robotů pro zvýšení throughputu
• Využití nových gelových materiálů pro ještě vyšší selektivitu extrakce
• Nasazení vysoce rozlišovací MS pro strukturální analýzy metabolitů
• Personalizovaná medicína: sledování biomarkerů v reálném čase

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda pro volné metanefriny v plasmatických vzorcích splňuje přísné požadavky na citlivost, přesnost a robustnost. Spojení ion-pairing SPE a PGC chromatografie zajišťuje spolehlivou separaci a kvantifikaci. Metoda je vhodná pro klinické laboratoře zaměřené na diagnostiku a výzkum feochromocytomů.

Reference

He X., Gabler J., Yuan C., Wang S., Shi Y., Kozak M. Quantitative Measurement of Plasma Free Metanephrines by Ion-pairing Solid Phase Extraction and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Porous Graphitic Carbon Column. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2011;879(23):2355–2359.