Low-flow On-line 2D LCMS Hyphenated with HRAM MS for Comprehensive Proteome Profiling

Význam tématu

Hloubková charakterizace proteomu je klíčová pro biomedicínský výzkum, klinickou diagnostiku i biotechnologické aplikace. Vzhledem k vysoké komplexitě a rozsahu dynamického rozsahu biologických vzorků, například lidské plazmy, je nutné vyvinout metody, které umožní získat co největší počet identifikovaných proteinů v rozumném čase a s vysokou reprodukovatelností. On-line dvoudimenzionální chromatografie spojená s vysokým rozlišením hmotnostní spektrometrie představuje moderní přístup, jak tyto požadavky naplnit.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem studie bylo navrhnout plně automatizovanou on-line 2D LC-MS/MS konfiguraci s nízkým průtokem, která zajistí hluboké profilování proteomu plazmy a buněčných digesovaných vzorků. Autoři využili kombinaci vysokopH reverzní fáze a nízkopH reverzní fáze v jednom plynulém on-line uspořádání, minimalizovali manuální manipulaci a maximalizovali dobu sběru fragmentačních spekter pro co nejlepší pokrytí proteomu.

Použitá metodika a instrumentace

Studie byla prováděna na systému Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano spojeném s Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap hmotnostním spektrometrem. Konfigurace zahrnovala:

• 1. dimenze: PepSwift monolitický kapilární PP kolona (100 µm x 250 mm) při vysokém pH (10 mM amoniaku, 0,3 µL/min)
• Přepínací ventil pro frakcionaci na 2, 4 nebo 8 frakcí sbíraných na trap kolony
• Make-up line s 0,05 % TFA pro okyselení eluátu a zajištění retence
• 2. dimenze: EASY-Spray kolona (75 µm x 150 mm) při nízkém pH (0,1 % FA, 0,4 µL/min)
• Q Exactive HF-X MS s režimy Full MS a DDA pro vysoko rozlišené analýzy

Hlavní výsledky a diskuse

Nová on-line 2D RP x RP metoda umožnila identifikovat v průměru 206 skupin proteinů při 2 frakcích, 265 při 4 frakcích a až 394 proteinových skupin při 8 frakcích z hrubého plazmatického digestu. Zvýšený počet frakcí a vyšší nálože vede k hlubší proteomové pokrytí bez zhoršení tvaru peptidových piků či šířky vrcholků. Reprodukabilita retenčních časů v obou dimenzích je srovnatelná s jedno-dimenzionálními běhy, což potvrzuje robustnost metody. Jednoduchý vzorkový preproces plazmy bez redukce či alkylace demonstroval významné zvýšení hloubky profilování bez manuálních kroků.

Přínosy a praktické využití metody

On-line 2D konfigurace nabízí vysokou automatizaci a minimální riziko ztráty vzorku. Díky snadnému nastavení přepínacích ventilů a volbě počtu frakcí je metoda flexibilní pro různé typy vzorků a potřeby hloubky analýzy. Vysoká reprodukovatelnost umožňuje rozvoj cílených kvantitativních metod (SRM/MRM či PRM) v komplexních biologických matricích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další optimalizace fázových chemických složení kolony pro zlepšení ortogonality rozdělení, rozšíření počtu frakcí nad osm a integrace rychlých datových vyhledávacích postupů. Pokročilé MS platformy s větší rychlostí sběru dat mohou dále zvýšit hloubku pokrytí proteomu. Aplikace se nabízí nejen v klinické proteomice, ale také v obszaru biomarkerů a biotechnologických kvalitativních kontrol.

Závěr

Studie představila jednoduché, ale výkonné on-line 2D LC-MS/MS řešení pro hloubkovou analýzu komplexních vzorků. Kombinace vysokého pH a nízkého pH reverzní fáze s nízkoproudovým nanoflowem a HRAM spektrometrem zajistila vysokou citlivost, reprodukovatelnost a výrazné zvýšení proteomového pokrytí bez rizika ztráty vzorku při manuálních krocích.

Reference

• RSLCnano pre-concentration nano LC kit P/N 6720.0310 v Ultimate 3000 RSLCnano Standard Applications Guide
• Boychenko O, Pynn C, van den Berg B, Arrey TN, Baynham M, Decrop R, Ruehl M. High-throughput capillary-flow LC-MS proteomics with maximum MS utilization. Thermo Fisher Scientific TN 72227