METHOD FOR HEART-CUT ANALYSIS USING NANOACQUITY UPLC WITH 2D TECHNOLOGY FOR PROTEOMIC SAMPLES

Význam tématu

Proteomické biomarkery z peptidových vzorků jsou často přítomny v nízkých koncentracích v komplexním matričním pozadí. Dvousměrná chromatografie RP/RP s high/low pH nabízí vysokou efektivitu separace a odstraňuje omezení SCX/RP přístupů při rozlišení peptidů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstruje implementaci heart-cut techniky na nanoACQUITY UPLC 2D systému pro cílenou analýzu vybraných peptidů. Hlavním cílem bylo porovnání kompletní 2D separace s heart-cut přístupem z hlediska kvality dat, kvantitativní přesnosti a časové úspory.

Použitá instrumentace

• LC/MS systém: nanoACQUITY UPLC 2D/SYNAPT HDMS
• První dimenze: XBridge C18 (300 µm × 5 cm, 5 µm), gradient 20 mM formiát pH 10 / acetonitril, 2 µL/min
• Druhá dimenze: BEH C18 (75 µm × 15 cm, 1,7 µm) s nástupním trapem Symmetry C18 (180 µm × 2 cm), gradient 5–40 % acetonitrilu při 0,3 µL/min
• Online ředění: 20 µL/min vodné fáze pro zachování peptidů během přenosu mezi dimenzemi
• Data processing: PLGS 2.4 s IdentityE Informatics, databáze E. coli s náhodnými sekvencemi

Hlavní výsledky a diskuse

Identifikace: 86–87 % peptidů se objevilo pouze v jedné frakci 2D analýzy. Heart-cut analýza (frakce 4) prokázala 81–83 % shodu peptidů vůči 2D metodě.
Kvantifikace: Label-free poměry pro standardní proteiny (BSA, Phos B, ADH, enoláza) se v heart-cut režimu lišily v průměru o méně než 8 % od teoretických hodnot, s RSD ~15 %.
Časová úspora: Plná 2D analýza pěti frakcí v trojím replikátu trvala 60 hodin, zatímco heart-cut zkrátila dobu na 15 hodin.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazná úspora času a nákladů v rámci validace biomarkerů
• Vysoká reprodukovatelnost a kvantitativní přesnost třídění cílených peptidů
• Možnost adaptace na cílené proteomické studie s omezeným počtem analyzovaných vzorků

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit o další dimenze separace, kombinovat s cílenými MS/MS přístupy (MRM/SRM) a integrovat do automatizovaných workflow pro vysokokapacitní validaci biomarkerů v klinickém prostředí.

Závěr

Heart-cut RP/RP chromatografie na 2D nanoACQUITY UPLC systému přináší srovnatelné kvalitatívní a kvantitativní výsledky jako kompletní 2D analýza při čtyřnásobném zkrácení doby měření, což ji činí efektivním nástrojem pro cílenou proteomickou validaci.

Reference

1. M. Gilar et al., J. Sep. Sci. 2005, 28, 1694–1703
2. J. Silva et al., Mol. Cell Proteomics, 2006, 144–156