Novel On-Line Multidimensional Low-Flow LCMS Setups for Comprehensive and Fast Proteome Profiling

Význam tématu

Komplexita lidského proteomu a tlak na vysokou propustnost v oblasti proteomických analýz vyžadují nové přístupy, které umožňují hluboké proteomové profilování v krátkém čase. Online dvoudimenzionální (2D) nízkoprůtoková LC-MS/MS metoda spojuje výhody vysoké účinnosti separace s nízkým rizikem ztrát vzorku a bez nutnosti offline frakcionace.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl představit jednoduché zapojení online 2D RP×RP separace pro hloubkovou analýzu proteomu během typické nano-LCMS doby měření (~2 hodiny). Metoda využívá vysoké pH pro první dimenzi a nízké pH pro druhou dimenzi, přičemž vzorek je automaticky rozdělen do čtyř frakcí a analyzován sekvenčně bez manuální manipulace.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci a detekci byly použity následující moduly a přístroje:

• Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano systém (moduly NCS-3500RS, NCP-3200RS, WPS-3000RS, VWD-3400RS)
• 10portový přepínací ventil pro přepojování mezi dimenzemi
• PepSwift Monolithic Capillary Column (200 µm × 250 mm) pro první dimenzi při pH 10, 1,5 µL/min
• 300 µm × 5 mm trapovací kazety pro akumulaci frakcí
• Thermo Scientific EASY-Spray LC Column (75 µm × 150 mm, 3 µm) pro druhou dimenzi při pH 2, 0,6 µL/min
• Thermo Scientific Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap mass spektrometr
• Softwary Xcalibur™ (řízení měření), Standard Instrument Integration (řízení LC), FreeStyle™ (zpracování dat)

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila automatické dělení digestu HeLa buněk na čtyři frakce během 90min gradientu v první dimenzi a následnou analýzu každé frakce v druhé dimenzi během cca 4 hodin celkově. Klíčové poznatky:

• Peptidové špičky byly v jednotlivých frakcích ostré a symetrické, bez významného překrytí mezi sousedními frakcemi.
• Díky optimalizovanému gradientu ve druhé dimenzi došlo k rovnoměrnému rozložení peptidů a vysokému využití MS (až 180 vzorků za 24 h).
• Metoda prokázala vysokou reprodukovatelnost retenčních časů na úrovni 1D separací.

Přínosy a praktické využití

Navržené řešení nabízí:

• Rychlé nasazení v rutinní laboratoři s minimem potřebného hardwaru (jediný přepínací ventil).
• Snížení komplexity vzorku bez offline manipulace a tím minimalizaci ztrát materiálu.
• Možnost hlubokého proteomového profilování i pro náročné biologické matice.
• Vysokou robustnost a reprodukovatelnost vhodnou pro kvantitativní a cílené analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda má potenciál pro další rozšíření:

• Implementace pro cílené LC-MS metody se scheduled akvizicí peptidů.
• Úprava počtu frakcí a délek gradientů pro specifické aplikace (biomarkery, klinické vzorky).
• Integrace s automatizovanými pracovišti a vysokokapacitními platformami.

Závěr

Online 2D nízkoprůtokový RP×RP přístup představuje perspektivní alternativu k dlouhým jednokolónovým separacím, umožňuje rychlé a hluboké proteomové profilování s vysokou opakovatelností a minimální manipulací se vzorkem.

Reference

1. RSLCnano pre-concentration nano LC kit (P/N 6720.0310) v rámci Ultimate 3000 RSLCnano Standard Applications Guide.
2. Boychenko A.; Pynn C.; van den Berg B.; Arrey T.N.; Baynham M.; Decrop R.; Ruehl M. High-throughput capillary-flow LC-MS proteomics with maximum MS utilization. TN 72227.