Extraction of a Range of Immunosuppressants from Whole Blood Using ISOLUTE® SLE+ Prior to LC-MS/MS Analysis

Význam tématu

Imunosupresiva se používají pro potlačení imunitní odpovědi při transplantacích a autoimunitních onemocněních. Stabilní a spolehlivé stanovení hladin těchto látek v krvi je klíčové pro terapeutický monitoring.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyhodnotit účinnost a reprodukovatelnost extrakce sirolimu, takrolimu, everolimu a cyklosporinu A z plné krve pomocí podporované kapalné extrakce (SLE+) před analýzou LC-MS/MS. Studie se zaměřila na výtěžnost, přesnost a časovou úspornost metody.

Použitá metodika a instrumentace

Popis vzorku a přípravy:

• 50 μl plné krve a 250 μl HPLC vody, vortex 30 s, centrifugace 12000 rpm, 10 min
• Loading 275 μl supernatantu na ISOLUTE SLE+ 400 μl destičku, adsorpce 5 min
• Extrahování 2×600 μl ethyl acetátu pod gravitačním tokem a následné vysušení při 30 °C
• Rekonstrukce v 100 μl vody:acetonitril (25:75, v/v)

Chromatografie LC-MS/MS:

• UPLC Waters ACQUITY BEH C18 50×2,1 mm, 1,7 μm, 10 μl injekce, kolona 60 °C, 10 °C vzorek
• Mobilní fáze A: 2 mM formiát amonný, 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě; B: 2 mM formiát amonný, 0,1 % kyseliny mravenčí v methanolu; gradient 25→75 % A→B
• Detekce: Premier XE triple kvadrupól s ESI, MRM přechody pro kvantifikaci a kvalifikaci analyzátů

Použitá instrumentace

• ISOLUTE SLE+ 400 μl destička (Biotage PN 820-0400-P01)
• Biotage PRESSURE+ 96 pozitivní tlaková manžeta
• Biotage VacMaster-96 manifold
• Biotage SPE Dry Sample Concentrator
• Waters ACQUITY UPLC systém
• Premier XE triple kvadrupólový hmotnostní spektrometr

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla výtěžností v rozmezí 60–97 % s relativními směrodatnými odchylkami pod 10 % pro všechny analyty. Neprojevila se tvorba emulzí a eliminovalo se riziko křížové reaktivity. Extrahované iontové chromatogramy ukazují čisté a dobře oddělené vrcholy.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rychlejší a efektivnější přípravu než klasická LLE a imunotesty. Zvyšuje spolehlivost TDM, snižuje náklady a zátěž personálu díky minimalizaci kroků a absence emulzí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se automatizace procesu SLE+, rozšíření panelu analyzátů o další imunosupresiva a farmakogenomické markery, integrace s robotickými systémy a aplikace na malé objemy vzorků (dried blood spots).

Závěr

Podporovaná kapalná extrakce ISOLUTE SLE+ v kombinaci s LC-MS/MS je spolehlivá, robustní a efektivní metoda pro kvantifikaci imunosupresiv z plné krve. Významně zlepšuje kontrolu léčby pacientů.

Reference