OPTIMALIZACE PŘÍPRAVY VZORKU PRO DVOUROZMĚRNOU ELEKTROFOR ÉZU

Význam tématu

Analýza proteomu pomocí dvourozměrné elektroforézy je zásadní pro odhalení strukturálních a funkčních změn proteinů v buňkách. Kvalita rozdělení proteinů na 2-DE gelu silně závisí na přípravě vzorku, zejména na účinné solubilizaci a ochraně proteinů před degradací.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo optimalizovat podmínky přípravy vzorku virově transformovaných kuřecích monoblastů BM2 tak, aby se maximalizoval počet rozlišených proteinových „spotů“. Autoři sledovali vliv složení lyzačního a rehydratačního pufru a aplikaci sonikace na kvalitu 2-DE.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky buněk BM2 byly lyzovány v chaotropně-detergentním lyzačním pufru obsahujícím močovinu, thiomočovinu, CHAPS, NP-40, DTT a amfolyty. Po sonikaci a centrifugaci byl supernatant doplněn rehydratačním pufrem a aplikován na IPG stripy pH 3–10 délky 7 cm. Izofokusace probíhala na zařízení Protean IEF Cell, následovala ekvilibrace v Tris-HCl pufru s glycerolem a DTT/jodacetamidem, a druhý rozměr (SDS-PAGE) na vertikální elektroforetické aparatuře Power-Pac 300.

Instrumentace:

• Sonikátor Sonopuls HD 2070
• Spektrofotometr Ultrospec 2000
• IEF fokusátor Protean IEF Cell
• Vertikální elektroforetická aparatura s napájecím zdrojem Power-Pac 300

Hlavní výsledky a diskuse

Přidání thiomočoviny do obou pufrů vedlo k 1,5–2× nárůstu rozlišených proteinových spotů oproti klasickému O’Farrellovu protokolu. Kombinace thiomočoviny s sonikací zvýšila počet detekovatelných proteinů až osminásobně a zároveň zlepšila intenzitu některých spotů díky lepší solubilizaci a ochraně před proteolýzou.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaný postup umožňuje detailnější mapování proteomu leukemických buněk s vysokým rozlišením, což usnadňuje identifikaci změn při diferenciaci, proliferaci a apoptóze. Zvýšená účinnost solubilizace je zvlášť přínosná pro studium hydrofobních a agregujících proteinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími směry jsou aplikace nových surfaktantů a chaotropů, integrace 2-DE s kvantitativními metodami hmotnostní spektrometrie a automatizace přípravy vzorku. Rovněž je perspektivní přenést optimalizovaný protokol na další buněčné linie a klinické vzorky s cílem standardizovat postupy proteomických analýz.

Závěr

Zavedení thiomočoviny do lyzačního a rehydratačního pufru společně se sonikací významně zlepšuje kvalitu a rozsah dvourozměrné elektroforézy proteomu BM2 buněk. Popsaný protokol poskytuje robustní základ pro další analýzy proteomických změn v leukemických buňkách.

Reference

1. Herbert B.: Electrophoresis 20, 660 (1999).
2. Bouchal P., Kučera I.: Chem. Listy 97, 29 (2003).
3. Moscovici C. et al.: Expression of Differentiated Functions in Cancer Cells, Raven Press 1982.
4. Rabilloud T.: Electrophoresis 17, 813 (1996).
5. Westermeier R., Naven T.: Proteomics in Practice. Wiley-VCH 2002.
6. Rabilloud T. et al.: Electrophoresis 18, 307 (1997).
7. Rabilloud T.: Electrophoresis 19, 758 (1998).
8. Adessi C. et al.: Electrophoresis 18, 127 (1997).
9. Harder A. et al.: Electrophoresis 20, 826 (1999).
10. O’Farrell P. H.: J. Biol. Chem. 250, 4007 (1975).
11. Macri J. et al.: Electrophoresis 21, 1685 (2000).
12. Castellanos-Serra L., Paz-Lago D.: Electrophoresis 23, 1745 (2002).