INTEGROVANÁ ŘEŠENÍ PRO PROTEOMICKÉ PRACOVNÍ POSTUPY - SIGMA-ALDRICH

Význam tématu

Proteomika zkoumá komplexní soubory proteinů ve vzorcích biologického původu. Kvalita a reprodukovatelnost experimentů závisí na efektivní přípravě vzorku, selektivní izolaci, separaci a kvantifikaci proteinů i jejich modifikací. Správné postupy přispívají k identifikaci biomarkerů, analýze posttranslačních modifikací a ke kvantitativním studiím, což je klíčové v klinické diagnostice, farmaceutickém vývoji a základním výzkumu.

Cíle a přehled studie / článku

Článek představuje integrované řešení pro proteomická workflow vyvinutá firmou Sigma-Aldrich. Popisuje sady a reagencie pro:

• přípravu vzorku pro 2D-gelovou elektroforézu včetně solubilizace membránových proteinů a selektivního odstranění albuminu a IgG,
• přípravu vzorku pro hmotnostní spektrometrii se zaměřením na analýzu fosfopeptidů, glykopeptidů a štěpení proteinu,
• kvantitativní proteomiku s využitím stabilně izotopově značených peptidů (Protein-AQUA™) a inkorporace 18O.

Použitá instrumentace

• Systémy 2D elektroforézy s IPG proužky a SDS-PAGE (4–20% a 4–12% gely),
• Hmotnostní spektrometry ABI 4700 TOF-TOF, MALDI-TOF, Agilent 1100 Kapilární LC s Finnigan LCQ Classic,
• Centrální chromatografické a afinitní kolony, centrifugační desaltingové kazety, ZIPTip® C18,
• ELISA pro ověření účinnosti odstranění albuminu a IgG.

Použitá metodika

• Solubilizace vzorku pro 2D elektroforézu pomocí sulfobetainových detergentů C7BzO, ASB-14 a optimalizovaných protokolů ProteoPrep®,
• Odstranění vysoce hojných sérových proteinů (albuminu, IgG) pomocí pryskyřic navázaných barvivem nebo protilátkami,
• Obohacení fosfopeptidů PHOS-Select™ kitem s 90% výtěžností fosforylovaných tryptických štěpů,
• Deglykosylace glykoproteinů enzymem PNGase F in-solution i in-gel,
• Proteolytické štěpení pomocí MS-grade trypsinu a alternativních proteas Protease Profiler™,
• Mikroizolace a guanidylace peptidů z MALDI terčíků pro zvýšení ionizace lysinových peptidů,
• Stabilní izotopové značení peptidů (Protein-AQUA™) pro absolutní kvantifikaci,
• 18O inkorporace do C-terminálních peptidů pomocí 18O Proteom Profiler™ kitu pro relativní srovnání proteinových populací.

Hlavní výsledky a diskuse

• Detergenty C7BzO v kombinaci s močovinou zlepšují extrakci membránových proteinů a stabilitu během IPG elektroforézy,
• ProteoPrep® sady dosahují >95% odstranění albuminu a >80% IgG bez potřeby proteinové srážky,
• PHOS-Select™ umožňuje 90% fosfopeptidovou selektivitu a efektivní detekci na TOF-TOF MS,
• Deglykosylace PNGase F obnažuje glykopeptidová místa vedoucí k jednoznačné identifikaci glykosylovaných zbytků α1-antitrypsinu,
• MS-grade trypsin a Protease Profiler™ zajišťují vyšší sekvenční pokrytí a spolehlivost analýzy,
• Guanidylace lysinových peptidů zvyšuje ionizační účinnost a sekvenční pokrytí při MALDI-TOF,
• Protein-AQUA™ poskytuje přesnost kvantifikace lepší než 2% v HPLC-MS,
• 18O značení přináší jednoduchou relativní kvantifikaci dvou populací proteinů s jasným posunem +4 Da.

Přínosy a praktické využití metody

Použití integrovaných sad a standardizovaných protokolů zkracuje dobu přípravy, minimalizuje variabilitu a eliminuje nutnost lokální optimalizace. Metody jsou vhodné pro preklinické i klinické laboratoře, farmaceutické výzkumné týmy a průmyslovou analytiku, kde se požaduje vysoká citlivost, výtěžnost a reprodukovatelnost.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření multiplexních izotopových štítků (iTRAQ, TMT),
• Automatizace přípravy vzorku a miniaturizace pracovních postupů,
• Integrace s LC-MS/MS a vysoko-výkonnými kvadrupólovými hybridními systémy,
• Bioinformatická podpora pro selekci optimálních AQUA peptidů,
• Cílené proteomické profilování klinických biomarkerů.

Závěr

Inovativní integrační řešení Sigma-Aldrich poskytují komplexní nástroje pro proteomické workflow od přípravy vzorku až po kvantitativní analýzu. Díky optimalizovaným detergentům, imunoafinitním metodám, selektivnímu obohacení a stabilně izotopovému značení dosahují výzkumné týmy vyšší spolehlivosti, citlivosti a reprodukovatelnosti výsledků.

Reference

1. Rabilloud T. et al. Electrophoresis 1999;20:3603–3616
2. Tastet C. et al. Proteomics 2003;3:111–121
3. Luche S. et al. Proteomics 2003;3:249–255
4. Rabilloud T. Electrophoresis 1996;17:813–818
5. Santoni V. et al. Electrophoresis 2000;21:1054–1060
6. Krause E. et al. Anal Chem 1999;71:4160–4164
7. Baumgart S. et al. Rapid Commun Mass Spectrom 2004;18:863–871
8. Zhu Y.F. et al. Rapid Commun Mass Spectrom 1995;9:1315–1322
9. Wenschuh H. et al. Rapid Commun Mass Spectrom 1998;12:115–123
10. Kratzer R. et al. Electrophoresis 1998;19:1910–1918
11. Beardsley R.L. et al. Rapid Commun Mass Spectrom 2000;14:2147–2153
12. Hale J.E. et al. Anal Biochem 2000;287:110–115
13. Brancia F.L. Rapid Commun Mass Spectrom 2000;14:2070–2075
14. Beardsley R.L. & Reilly J.P. Anal Chem 2002;74:1884–1890
15. Thevis M. et al. J Proteome Res 2003;2:163–172
16. Fenaille F. et al. J Mass Spectrom 2004;39:16–24
17. Brancia F.L. et al. Rapid Commun Mass Spectrom 2002;16:2255–2262
18. Rosenfeld J.M. Trends Anal Chem 2003;22:785–793
19. Zhen Y. et al. J Am Soc Mass Spectrom 2004;15:803–813
20. Bodnar W.M. et al. J Am Soc Mass Spectrom 2003;14:971–980
21. Stemmann O. et al. Cell 2001;107:715–726
22. Gerber S.A. et al. PNAS 2003;100:6940–6945
23. Kirkpatrick D.S. et al. Methods 2005;35:265–273
24. Desiere F. et al. Genome Biol 2005;6:R9
25. Owens R.M. et al. EMBO J 2004;23:3375–3385