DVOUROZMĚRNÁ ELEKTROFORÉZA V PROTEOMICE: PRINCIPY A APLIKACE

Význam tématu

Studium proteomu pomocí dvourozměrné elektroforézy (2-DE) patří k základním metodám proteomiky. Umožňuje komplexní analýzu složení a kvantitativních změn proteinů v buňkách, tkáních či biologických tekutinách za různých podmínek. Díky vysokému rozlišení a možnosti vizualizace stovek až tisíců proteinových skvrn poskytuje 2-DE klíčová data o regulačních mechanismech, posttranslačních modifikacích a funkčních reakcích organismů.

Cíle a přehled studie

Článek poskytuje metodický přehled principů dvourozměrné elektroforézy, včetně přípravy vzorku, optimalizace separace a zobrazovacích technik. Popisuje následné postupy analýzy a identifikace proteinů pomocí image analýzy a metod hmotnostní spektrometrie, jakož i možnosti vyhledávání v databázích. Cílem je seznámit čtenáře s hlavními kroky proteomické workflow a vysvětlit, jak lze výsledná data využít v praxi.

Použitá metodika a instrumentace

Postup zahrnuje:

• Příprava vzorku – lyze buněk či organel, solubilizace chaotropními činidly (močovina, thiomočovina) a detergen­ty (CHAPS, ASB 14), odstranění nukleových kyselin a inhibitorů proteas.
• První rozměr – isoelektrická fokusace na IPG proužcích s imobilizovaným pH gradientem.
• Druhý rozměr – běh SDS-PAGE na deskových gelech, separace podle relativní molekulové hmotnosti.
• Vizualizace – barvení Coomassie Brilliant Blue, stříbrem, případně fluorescenčními barvivy SYPRO Ruby nebo DIGE.
• Image analýza – snímání CCD kamerou či skenerem, vyhodnocení počtu a intenzity skvrn pomocí software (PDQUEST, Melanie, ImageMaster).
• Identifikace – enzymatické štěpení trypsinem, MALDI-TOF MS a tandemová MS/MS, porovnání peptidových fingerprintů s databázemi (Swiss-Prot, TrEMBL, NCBI).

Hlavní výsledky a diskuse

Popis metody zdůrazňuje kritické kroky, zejména solubilizaci obtížně rozpustných membránových proteinů a eliminaci artefaktů. Komerční IPG proužky umožňují vyšší load vzorku a lepší reproducibilitu než CA-IEF trubičkové gely. Optimalizace barvicích protokolů stříbrem a fluorescenčními barvivy zvyšuje citlivost a kompatibilitu s MS. Diskuse se věnuje i alternativám 2-DE, jako jsou DIGE a štěpení proteinů přímo na proužcích, a dalším analytickým postupům (ICAT, Western blotting).

Přínosy a praktické využití metody

2-DE je stále klíčová pro:

• Mapování proteomu mikroorganismů a srovnávací analýzy vlivu růstových podmínek.
• Studium posttranslačních modifikací a indukce proteinů v responzu na stresory, léky či hormony.
• Objev biomarkerů v onkologii, mikrobiologii a farmaceutickém vývoji.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj automatizace a miniaturizace 2-DE, implementace pokročilých fluorescenčních metod DIGE, integrace s kvantitativními metodami MS a rozšíření bioinformatických nástrojů pro zpracování velkých dat. Důležitým směrem je také zlepšení analýzy membránových a nízce exprimovaných proteinů.

Závěr

Dvourozměrná elektroforéza zůstává nezastupitelnou technikou proteomiky díky svému vysokému rozlišení a schopnosti zobrazit komplexní proteomické změny. Kombinace s moderními zobrazovacími a identifikačními technologiemi poskytuje silný nástroj pro výzkum základních i aplikovaných otázek v biomedicíně a biotechnologiích.

Použitá instrumentace

• Zařízení PROTEAN II xi Cell (Bio-Rad) pro 2-DE elektroforézu.
• CCD kamera a densitometr pro snímání gelů.
• Hmotnostní spektrometr MALDI-TOF a tandemový MS/MS.
• Software PDQUEST, Melanie, ImageMaster pro analýzu gelů.

Reference

1. Wasinger V. C., Cordwell S. J., Cerpa-Poljak A., Yan J. X., Gooley A. A., Wilkins M. R., Duncan M. W., Harris R., Williams K. L., Humphery-Smith I.: Electrophoresis 16, 1090 (1995).
2. Humphery-Smith I., Cordwell S. J., Blackstock W. P.: Electrophoresis 18, 1217 (1997).
3. O’Farrell P. H.: J. Biol. Chem. 250, 4007 (1975).
4. Klose J.: Humangenetik 26, 231 (1975).
5. Rabilloud T.: Electrophoresis 17, 813 (1996).
6. Molloy M. P., Herbert B. R., Walsh B. J., Tyler M. I., Traini M., Sanchez J. C., Hochstrasser D. F., Williams K. L., Gooley A. A.: Electrophoresis 19, 837 (1998).
7. Link A. J. (ed.): 2-D Proteome Analysis Protocols. Humana Press, Totowa (1999).
8. Berkelman T., Stenstedt T.: 2-D Electrophoresis Using Immobilized pH Gradients. Amersham Pharmacia Biotech (1998).
9. Chevallet M., Santoni V., Poinas A., Rouquier D., Fuchs A., Kieffer S., Rossignol M., Lunardi J., Garin J., Rabilloud T.: Electrophoresis 19, 1901 (1998).
10. Görg A., Obermaier C., Boguth G., Scheibe B., Wildgruber R., Weiss W.: Electrophoresis 21, 1037 (2000).